304 stainless steel coil tubing chemical component , Ang istraktura ng SPACA6 ectodomain ay naglalaman ng isang conserved superfamily ng mga protina na nauugnay sa gamete fusion.

Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Gumagamit ka ng bersyon ng browser na may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Bilang karagdagan, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipinapakita namin ang site na walang mga istilo at JavaScript.
Mga slider na nagpapakita ng tatlong artikulo sa bawat slide.Gamitin ang likod at susunod na mga pindutan upang lumipat sa mga slide, o ang mga pindutan ng slide controller sa dulo upang lumipat sa bawat slide.

Ang SPACA6 ay isang sperm-expressed surface protein na kritikal para sa gamete fusion sa panahon ng mammalian sexual reproduction.Sa kabila ng pangunahing papel na ito, ang tiyak na pag-andar ng SPACA6 ay hindi gaanong nauunawaan.Pinapaliwanag namin ang kristal na istraktura ng extracellular domain ng SPACA6 sa isang resolusyon na 2.2 Å, na nagpapakita ng isang dalawang-domain na protina na binubuo ng isang apat na stranded na bundle at Ig-like β-sandwich na sinamahan ng mga quasi-flexible na linker.Ang istraktura na ito ay kahawig ng IZUMO1, isa pang protina na nauugnay sa gamete fusion, na ginagawang SPACA6 at IZUMO1 na mga founding member ng superfamily ng mga fertilization-associated protein na tinutukoy dito bilang IST superfamily.Ang IST superfamily ay structurally na tinukoy sa pamamagitan ng twisted four-helix bundle nito at isang pares ng disulfide-linked CXXC motifs.Ang isang structure-based na AlphaFold na paghahanap ng human proteome ay nakilala ang mga karagdagang miyembro ng protina ng superfamily na ito;kapansin-pansin, marami sa mga protina na ito ay kasangkot sa gamete fusion.Ang istraktura ng SPACA6 at ang kaugnayan nito sa iba pang mga miyembro ng IST superfamily ay nagbibigay ng nawawalang link sa aming kaalaman sa mammalian gamete fusion.
Ang bawat buhay ng tao ay nagsisimula sa dalawang magkahiwalay na haploid gametes: ang tamud ng ama at ang itlog ng ina.Ang tamud na ito ang nagwagi sa isang matinding proseso ng pagpili kung saan ang milyun-milyong selula ng tamud ay dumaan sa genital tract ng babae, nagtagumpay sa iba't ibang mga hadlang1 at sumasailalim sa kapasidad, na nagpapataas ng kanilang motility at ang proseso ng mga sangkap sa ibabaw2,3,4.Kahit na ang tamud at oocyte ay natagpuan ang isa't isa, ang proseso ay hindi pa tapos.Ang oocyte ay napapalibutan ng isang layer ng cumulus cells at isang glycoprotein barrier na tinatawag na zona pellucida, kung saan dapat dumaan ang tamud upang makapasok sa oocyte.Gumagamit ang Spermatozoa ng kumbinasyon ng mga molekula ng surface adhesion at membrane-associated at secreted enzymes upang malampasan ang mga huling hadlang na ito5.Ang mga molekula at enzyme na ito ay pangunahing nakaimbak sa panloob na lamad at acrosomal matrix at natutukoy kapag ang panlabas na lamad ng tamud ay na-lysed sa panahon ng reaksyong acrosomal6.Ang huling hakbang sa matinding paglalakbay na ito ay ang sperm-egg fusion event, kung saan pinagsasama ng dalawang cell ang kanilang mga lamad upang maging isang diploid na organismo7.Bagaman ang prosesong ito ay groundbreaking sa pagpaparami ng tao, ang mga kinakailangang molekular na pakikipag-ugnayan ay hindi gaanong nauunawaan.
Bilang karagdagan sa pagpapabunga ng mga gametes, ang kimika ng pagsasanib ng dalawang lipid bilayer ay malawakang pinag-aralan.Sa pangkalahatan, ang pagsasanib ng lamad ay isang masiglang hindi kanais-nais na proseso na nangangailangan ng isang katalista ng protina upang sumailalim sa pagbabago ng structural conformation na naglalapit sa dalawang lamad, sinira ang kanilang pagpapatuloy at nagiging sanhi ng pagsasanib8,9.Ang mga protein catalyst na ito ay kilala bilang fusogens at natagpuan sa hindi mabilang na mga fusion system.Kinakailangan ang mga ito para sa pagpasok ng virus sa mga host cell (hal., gp160 sa HIV-1, spike sa mga coronavirus, hemagglutinin sa mga influenza virus)10,11,12 placental (syncytin)13,14,15 at gamete-forming fusion sa lower eukaryotes ( HAP2/GCS1 sa mga halaman, protista at arthropod) 16,17,18,19.Ang mga fusogens para sa mga gametes ng tao ay hindi pa natuklasan, bagaman maraming mga protina ang ipinakita na kritikal para sa gamete attachment at fusion.Ang oocyte-expressed CD9, isang transmembrane protein na kinakailangan para sa pagsasanib ng mouse at human gametes, ay ang unang natuklasan 21,22,23.Kahit na ang tumpak na pag-andar nito ay nananatiling hindi maliwanag, isang papel sa pagdirikit, ang istraktura ng adhesion foci sa microvilli ng itlog, at/o ang tamang lokalisasyon ng mga protina sa ibabaw ng oocyte ay tila malamang na 24,25,26.Ang dalawang pinakakaraniwang protina na kritikal para sa gamete fusion ay ang sperm protein IZUMO127 at ang oocyte protein na JUNO28, at ang kanilang mutual association ay isang mahalagang hakbang sa gamete recognition at adhesion bago ang fusion.Ang mga lalaking Izumo1 knockout na daga at ang babaeng Juno knockout na mga daga ay ganap na sterile, sa mga modelong ito ang tamud ay pumapasok sa perivitelline space ngunit ang mga gamete ay hindi nagsasama.Katulad nito, nabawasan ang confluence kapag ang mga gametes ay ginagamot ng anti-IZUMO1 o JUNO27,29 antibodies sa mga eksperimento sa in vitro fertilization ng tao.
Kamakailan lamang, natuklasan ang isang bagong natuklasang grupo ng mga protina na ipinahayag ng tamud na phenotypical na katulad ng IZUMO1 at JUNO20,30,31,32,33,34,35.Ang sperm acrosomal membrane-associated protein 6 (SPACA6) ay kinilala bilang mahalaga para sa pagpapabunga sa isang malakihang pag-aaral ng murine mutagenesis.Ang pagpasok ng transgene sa Spaca6 gene ay gumagawa ng nonfusible spermatozoa, bagaman ang mga spermatozoa na ito ay pumapasok sa perivitelline space 36 .Ang mga kasunod na pag-aaral ng knockout sa mga daga ay nakumpirma na ang Spaca6 ay kinakailangan para sa gamete fusion 30,32 .Ang SPACA6 ay ipinahayag halos eksklusibo sa mga testes at may pattern ng lokalisasyon na katulad ng sa IZUMO1, lalo na sa loob ng intima ng spermatozoa bago ang reaksyon ng acrosomal, at pagkatapos ay lumipat sa rehiyon ng ekwador pagkatapos ng reaksyon ng acrosomal 30,32.Ang Spaca6 homologues ay umiiral sa iba't ibang mammal at iba pang eukaryotes 30 at ang kahalagahan nito para sa gamete fusion ng tao ay ipinakita sa pamamagitan ng pagsugpo sa pagpapabunga ng tao sa vitro sa pamamagitan ng paglaban sa SPACA6 30 .Hindi tulad ng IZUMO1 at JUNO, ang mga detalye ng istraktura, pakikipag-ugnayan, at paggana ng SPACA6 ay nananatiling hindi malinaw.
Upang mas maunawaan ang pangunahing prosesong pinagbabatayan ng pagsasanib ng tamud at mga itlog ng tao, na magbibigay-daan sa amin na ipaalam ang mga pag-unlad sa hinaharap sa pagpaplano ng pamilya at paggamot sa pagkamayabong, nagsagawa kami ng SPACA6 structural at biochemical studies.Ang kristal na istraktura ng extracellular domain ng SPACA6 ay nagpapakita ng isang four-helical bundle (4HB) at isang immunoglobulin-like (Ig-like) na domain na konektado ng quasi-flexible na mga rehiyon.Tulad ng hinulaang sa mga nakaraang pag-aaral, 7, 32, 37 ang istraktura ng domain ng SPACA6 ay katulad ng sa IZUMO1 ng tao, at ang dalawang protina ay nagbabahagi ng isang hindi pangkaraniwang motif: 4HB na may isang tatsulok na helical na ibabaw at isang pares ng disulfide-linked CXXC motifs.Iminumungkahi namin na ang IZUMO1 at SPACA6 ngayon ay tumutukoy sa isang mas malaki, istrukturang nauugnay na superfamily ng mga protina na nauugnay sa gamete fusion.Gamit ang mga feature na natatangi sa superfamily, nagsagawa kami ng kumpletong paghahanap para sa AlphaFold structural human proteome, na tinutukoy ang mga karagdagang miyembro ng superfamily na ito, kabilang ang ilang miyembrong kasangkot sa gamete fusion at/o fertilization.Lumilitaw na ngayon na mayroong isang karaniwang fold ng istruktura at superfamily ng mga protina na nauugnay sa gamete fusion, at ang aming istraktura ay nagbibigay ng isang molekular na mapa ng mahalagang aspeto na ito ng mekanismo ng gamete fusion ng tao.
Ang SPACA6 ay isang single-pass transmembrane protein na may isang N-linked glycan at anim na putative disulfide bond (Mga Figure S1a at S2).Ipinahayag namin ang extracellular domain ng SPACA6 ng tao (nalalabi 27–246) sa mga cell ng Drosophila S2 at nilinis ang protina gamit ang nickel affinity, cation exchange, at size exclusion chromatography (Fig. S1b).Ang purified SPACA6 ectodomain ay napaka-stable at homogenous.Ang pagsusuri gamit ang size exclusion chromatography na sinamahan ng polygonal light scattering (SEC-MALS) ay nagsiwalat ng isang peak na may kalkuladong molekular na timbang na 26.2 ± 0.5 kDa (Fig. S1c).Ito ay naaayon sa laki ng SPACA6 monomeric ectodomain, na nagpapahiwatig na ang oligomerization ay hindi nangyari sa panahon ng paglilinis.Bilang karagdagan, ang circular dichroism (CD) spectroscopy ay nagsiwalat ng isang halo-halong istraktura ng α/β na may punto ng pagkatunaw na 51.3 °C (Fig. S1d,e).Ang deconvolution ng CD spectra ay nagsiwalat ng 38.6% α-helical at 15.8% β-stranded na elemento (Larawan S1d).
Ang SPACA6 ectodomain ay na-kristal gamit ang random na matrix seeding38 na nagreresulta sa isang set ng data na may resolusyon na 2.2 Å (Talahanayan 1 at Larawan S3).Gamit ang kumbinasyon ng fragment-based na molecular substitution at SAD phasing data na may bromide exposure para sa pagpapasiya ng istraktura (Talahanayan 1 at Figure S4), ang panghuling pinong modelo ay binubuo ng mga nalalabi 27–246.Sa oras na natukoy ang istraktura, walang magagamit na mga istrukturang pang-eksperimento o AlphaFold.Ang SPACA6 ectodomain ay may sukat na 20 Å × 20 Å × 85 Å, na binubuo ng pitong helice at siyam na β-strands, at may pinahabang tertiary fold na pinatatag ng anim na disulfide bond (Fig. 1a, b).Ang mahinang density ng elektron sa dulo ng Asn243 side chain ay nagpapahiwatig na ang nalalabi na ito ay isang N-linked glycosylation.Ang istraktura ay binubuo ng dalawang domain: isang N-terminal na four-helix bundle (4HB) at isang C-terminal na Ig-like na domain na may intermediate hinge region sa pagitan ng mga ito (Fig. 1c).
isang Istraktura ng extracellular domain ng SPACA6.Strip diagram ng extracellular domain ng SPACA6, ang kulay ng chain mula N hanggang C-terminus mula sa dark blue hanggang dark red.Ang mga cysteine ​​na kasangkot sa mga bono ng disulfide ay naka-highlight sa magenta.b Topology ng extracellular domain ng SPACA6.Gamitin ang parehong scheme ng kulay tulad ng sa Figure 1a.c SPACA6 extracellular domain.Ang 4HB, hinge, at tulad ng Ig na mga strip chart ng domain ay may kulay na orange, berde, at asul, ayon sa pagkakabanggit.Ang mga layer ay hindi iginuhit sa sukat.
Kasama sa 4HB domain ng SPACA6 ang apat na pangunahing helice (helice 1–4), na nakaayos sa anyo ng helical helix (Fig. 2a), na nagpapalit-palit sa pagitan ng antiparallel at parallel na pakikipag-ugnayan (Fig. 2b).Ang isang maliit na karagdagang single-turn helix (helix 1′) ay inilalagay patayo sa bundle, na bumubuo ng isang tatsulok na may mga helice 1 at 2. Ang tatsulok na ito ay bahagyang deformed sa helical-twisted packing ng medyo siksik na packing ng helices 3 at 4 ( Larawan 2a).
4HB N-terminal strip chart.b Nangungunang view ng isang bundle ng apat na helice, ang bawat helix ay naka-highlight sa dark blue sa N-terminus at dark red sa C-terminus.c Top-down na spiral wheel diagram para sa 4HB, na ang bawat nalalabi ay ipinapakita bilang isang bilog na may label na may isang solong titik na amino acid code;tanging ang apat na amino acid sa tuktok ng gulong ang binibilang.Ang mga non-polar residues ay may kulay na dilaw, ang mga polar na hindi nakakargang residue ay may kulay na berde, ang positively charged residues ay may kulay na asul, at ang mga negatibong naka-charge na residu ay may kulay na pula.d Mga tatsulok na mukha ng 4HB domain, na may 4HB na kulay kahel at mga bisagra sa berde.Ang parehong mga inset ay nagpapakita ng hugis ng baras na disulfide bond.
Ang 4HB ay puro sa isang panloob na hydrophobic core na binubuo pangunahin ng mga aliphatic at aromatic residues (Fig. 2c).Ang core ay naglalaman ng isang disulfide bond sa pagitan ng Cys41 at Cys55 na nag-uugnay sa mga helice 1 at 2 nang magkasama sa isang itaas na nakataas na tatsulok (Larawan 2d).Dalawang karagdagang disulfide bond ang nabuo sa pagitan ng CXXC motif sa Helix 1′ at isa pang CXXC motif na matatagpuan sa dulo ng β-hairpin sa hinge region (Fig. 2d).Ang isang konserbatibong residue ng arginine na may hindi kilalang function (Arg37) ay matatagpuan sa loob ng guwang na tatsulok na nabuo ng mga helice 1′, 1, at 2. Ang aliphatic carbon atoms na Cβ, Cγ, at Cδ Arg37 ay nakikipag-ugnayan sa hydrophobic core, at ang mga guanidine group nito ay paikot-ikot na gumagalaw. sa pagitan ng mga helice 1′ at 1 sa pamamagitan ng mga pakikipag-ugnayan sa pagitan ng Thr32 backbone at side chain (Fig. S5a, b).Ang Tyr34 ay umaabot sa cavity na nag-iiwan ng dalawang maliliit na cavity kung saan maaaring makipag-ugnayan ang Arg37 sa solvent.
Ang mga Ig-like β-sandwich domain ay isang malaking superfamily ng mga protina na nagbabahagi ng karaniwang katangian ng dalawa o higit pang multi-stranded amphipathic β-sheet na nakikipag-ugnayan sa pamamagitan ng hydrophobic core 39. Ang C-terminal Ig-like domain ng SPACA6 ay may parehong pattern at binubuo ng dalawang layer (Fig. S6a).Ang Sheet 1 ay isang β-sheet ng apat na strand (strands D, F, H, at I) kung saan ang mga strand F, H, at I ay bumubuo ng isang anti-parallel arrangement, at ang mga strand na I at D ay nagkakaroon ng parallel interaction.Ang talahanayan 2 ay isang maliit na anti-parallel double-stranded beta sheet (strands E at G).Ang panloob na disulfide bond ay naobserbahan sa pagitan ng C-terminus ng E chain at sa gitna ng H chain (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Ang disulfide bond na ito ay kahalintulad sa disulfide bond sa β-sandwich domain ng immunoglobulin40,41.
Ang apat na strand na β-sheet ay umiikot sa buong haba nito, na bumubuo ng mga asymmetrical na gilid na naiiba sa hugis at electrostatics.Ang mas manipis na gilid ay isang patag na hydrophobic na pangkapaligiran na ibabaw na namumukod-tangi kumpara sa natitirang hindi pantay at electrostatically diverse na mga ibabaw sa SPACA6 (Fig. S6b,c).Isang halo ng nakalantad na backbone na carbonyl/amino group at polar side chain ang pumapalibot sa hydrophobic surface (Fig. S6c).Ang mas malawak na margin ay sakop ng isang naka-cap na helical segment na humaharang sa N-terminal na bahagi ng hydrophobic core at bumubuo ng tatlong hydrogen bond na may bukas na polar group ng F chain backbone (Fig. S6d).Ang C-terminal na bahagi ng gilid na ito ay bumubuo ng isang malaking bulsa na may bahagyang nakalantad na hydrophobic core.Ang bulsa ay napapalibutan ng mga positibong singil dahil sa tatlong set ng double arginine residues (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 at Arg212-Arg214) at isang central histidine (His220) (Figure S6e).
Ang hinge region ay isang maikling segment sa pagitan ng helical domain at ng Ig-like domain, na binubuo ng isang antiparallel three-stranded β-layer (strands A, B at C), isang maliit na 310 helix, at ilang mahabang random na helical segment.(Larawan S7).Ang isang network ng mga covalent at electrostatic contact sa rehiyon ng bisagra ay lilitaw upang patatagin ang oryentasyon sa pagitan ng 4HB at ang tulad ng Ig na domain.Ang network ay maaaring nahahati sa tatlong bahagi.Kasama sa unang bahagi ang dalawang CXXC motif (27CXXC30 at 139CXXC142) na bumubuo ng isang pares ng disulfide bond sa pagitan ng β-hairpin sa bisagra at ng 1′ helix sa 4HB.Kasama sa ikalawang bahagi ang mga electrostatic na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng Ig-like na domain at ng bisagra.Ang Glu132 sa bisagra ay bumubuo ng salt bridge na may Arg233 sa Ig-like domain at Arg135 sa hinge.Kasama sa ikatlong bahagi ang isang covalent bond sa pagitan ng Ig-like domain at ng hinge region.Dalawang disulfide bond (Cys124-Cys147 at Cys128-Cys153) ang nagkokonekta sa hinge loop sa isang linker na pinatatag ng electrostatic na mga interaksyon sa pagitan ng Gln131 at ng backbone functional group, na nagbibigay-daan sa pag-access sa unang Ig-like na domain.kadena.
Ang istruktura ng SPACA6 ectodomain at mga indibidwal na istruktura ng 4HB at Ig-like na mga domain ay ginamit upang maghanap ng mga structurally similar records sa mga database ng protina 42 .Natukoy namin ang mga tugma na may matataas na marka ng Dali Z, maliliit na standard deviation, at malalaking marka ng LALI (ang huli ay ang bilang ng mga residue na katumbas ng istruktura).Habang ang unang 10 hit mula sa buong paghahanap sa ectodomain (Talahanayan S1) ay may katanggap-tanggap na Z-score na >842, ang paghahanap para sa 4HB o Ig-like na domain lamang ay nagpakita na karamihan sa mga hit na ito ay tumutugma sa β-sandwich lamang.isang ubiquitous fold na matatagpuan sa maraming protina.Ang lahat ng tatlong paghahanap sa Dali ay nagbalik lamang ng isang resulta: IZUMO1.
Matagal nang iminungkahi na ang SPACA6 at IZUMO1 ay nagbabahagi ng pagkakatulad sa istruktura7,32,37.Bagama't ang mga ectodomain ng dalawang gamete fusion-associated protein na ito ay nagbabahagi lamang ng 21% sequence identity (Figure S8a), kumplikadong ebidensya, kabilang ang isang conserved disulfide bond pattern at isang hinulaang C-terminal Ig-like domain sa SPACA6, pinapayagan ang mga maagang pagtatangka na bumuo ng isang homology model ng A at SPACA6 mouse gamit ang IZUMO1 bilang template37.Kinukumpirma ng aming istraktura ang mga hulang ito at ipinapakita ang tunay na antas ng pagkakatulad.Sa katunayan, ang mga istruktura ng SPACA6 at IZUMO137,43,44 ay nagbabahagi ng parehong dalawang-domain na arkitektura (Fig. S8b) na may magkatulad na 4HB at Ig-like β-sandwich na mga domain na konektado ng isang hinge region (Fig. S8c).
Ang IZUMO1 at SPACA6 4HB ay may mga karaniwang pagkakaiba mula sa mga nakasanayang spiral bundle.Karaniwang 4HBs, tulad ng mga matatagpuan sa SNARE protein complexes na kasangkot sa endosomal fusion 45,46, ay may pantay na espasyo na mga helice na nagpapanatili ng pare-parehong curvature sa paligid ng isang central axis 47. Sa kaibahan, ang helical domain sa parehong IZUMO1 at SPACA6 ay nasira, na may variable na curvature at hindi pantay na pag-iimpake (Figure S8d).Ang twist, marahil ay sanhi ng tatsulok na nabuo ng mga helice 1′, 1 at 2, ay pinanatili sa IZUMO1 at SPACA6 at pinatatag ng parehong CXXC motif sa helix 1′.Gayunpaman, ang karagdagang disulfide bond na matatagpuan sa SPACA6 (Cys41 at Cys55 na magkakaugnay na nag-uugnay sa mga helice 1 at 2 sa itaas) ay lumilikha ng isang mas matalas na tuktok sa tatsulok na tuktok, na ginagawang mas baluktot ang SPACA6 kaysa sa IZUMO1, na may mas malinaw na mga tatsulok ng lukab.Bilang karagdagan, ang IZUMO1 ay kulang sa Arg37 na sinusunod sa gitna ng lukab na ito sa SPACA6.Sa kaibahan, ang IZUMO1 ay may mas karaniwang hydrophobic core ng aliphatic at aromatic residues.
Ang IZUMO1 ay may tulad-Ig na domain na binubuo ng isang double-stranded at limang-stranded na β-sheet43.Ang sobrang strand sa IZUMO1 ay pinapalitan ang coil sa SPACA6, na nakikipag-ugnayan sa F strand upang limitahan ang backbone hydrogen bond sa strand.Ang isang kagiliw-giliw na punto ng paghahambing ay ang hinulaang singil sa ibabaw ng mga domain na tulad ng Ig ng dalawang protina.Ang ibabaw ng IZUMO1 ay mas negatibong na-charge kaysa sa ibabaw ng SPACA6.Ang isang karagdagang singil ay matatagpuan malapit sa C-terminus na nakaharap sa sperm membrane.Sa SPACA6, ang parehong mga rehiyon ay mas neutral o positibong sisingilin (Fig. S8e).Halimbawa, ang hydrophobic surface (thinner edges) at positively charged pit (mas malawak na edge) sa SPACA6 ay negatibong na-charge sa IZUMO1.
Bagaman ang ugnayan at mga elemento ng pangalawang istraktura sa pagitan ng IZUMO1 at SPACA6 ay mahusay na napanatili, ang pagkakahanay ng istruktura ng mga domain na tulad ng Ig ay nagpakita na ang dalawang domain ay naiiba sa kanilang pangkalahatang oryentasyon na nauugnay sa bawat isa (Fig. S9).Ang spiral bundle ng IZUMO1 ay nakakurba tungkol sa β-sandwich, na lumilikha ng dating inilarawan na "boomerang" na hugis sa humigit-kumulang 50° mula sa gitnang axis.Sa kaibahan, ang helical beam sa SPACA6 ay tumagilid ng halos 10° sa kabaligtaran na direksyon.Ang mga pagkakaiba sa mga oryentasyong ito ay malamang dahil sa mga pagkakaiba sa rehiyon ng bisagra.Sa pangunahing antas ng pagkakasunud-sunod, ang IZUMO1 at SPACA6 ay nagbabahagi ng maliit na pagkakatulad ng pagkakasunud-sunod sa bisagra, maliban sa mga residue ng cysteine, glycine, at aspartic acid.Bilang resulta, ang mga hydrogen bond at electrostatic network ay ganap na naiiba.Ang mga elemento ng pangalawang istraktura ng β-sheet ay ibinabahagi ng IZUMO1 at SPACA6, kahit na ang mga chain sa IZUMO1 ay mas mahaba at ang 310 helix (helix 5) ay natatangi sa SPACA6.Ang mga pagkakaibang ito ay nagreresulta sa magkakaibang mga oryentasyon ng domain para sa dalawang magkatulad na protina.
Ang aming paghahanap sa server ng Dali ay nagsiwalat na ang SPACA6 at IZUMO1 ay ang dalawa lamang na eksperimento na tinutukoy na mga istruktura na nakaimbak sa database ng protina na may ganitong partikular na 4HB fold (Table S1).Kamakailan lamang, binuo ng DeepMind (Alphabet/Google) ang AlphaFold, isang neural network based system na tumpak na mahulaan ang mga 3D na istruktura ng mga protina mula sa mga pangunahing sequence48.Di-nagtagal pagkatapos naming malutas ang istraktura ng SPACA6, ang database ng AlphaFold ay inilabas, na nagbibigay ng mga predictive na modelo ng istraktura na sumasaklaw sa 98.5% ng lahat ng mga protina sa proteome ng tao48,49.Gamit ang aming nalutas na istraktura ng SPACA6 bilang isang modelo ng paghahanap, isang structural homology na paghahanap para sa modelo sa AlphaFold human proteome ay nakilala ang mga kandidato na may posibleng pagkakatulad sa istruktura sa SPACA6 at IZUMO1.Dahil sa hindi kapani-paniwalang katumpakan ng AlphaFold sa paghula ng SPACA6 (Fig. S10a)—lalo na ang 1.1 Å rms ectodomain kumpara sa aming nalutas na istraktura (Fig. S10b)—makakatiwala tayo na malamang na tumpak ang mga tinukoy na tugma ng SPACA6.
Noong nakaraan, hinanap ng PSI-BLAST ang kumpol ng IZUMO1 na may tatlong iba pang mga protina na nauugnay sa sperm: IZUMO2, IZUMO3, at IZUMO450.Hinulaan ng AlphaFold na ang mga protina ng pamilyang IZUMO na ito ay nakatiklop sa 4HB domain na may parehong pattern ng disulfide bond bilang IZUMO1 (Mga Figures 3a at S11), kahit na kulang sila ng isang domain na tulad ng Ig.Ito ay hypothesized na ang IZUMO2 at IZUMO3 ay isang panig na mga protina ng lamad na katulad ng IZUMO1, habang ang IZUMO4 ay lumilitaw na sikreto.Ang mga pag-andar ng IZUMO 2, 3, at 4 na protina sa gamete fusion ay hindi pa natukoy.Ang IZUMO3 ay kilala na gumaganap ng isang papel sa acrosome biogenesis sa panahon ng sperm development51 at ang IZUMO protein ay natagpuan na bumubuo ng isang complex50.Ang pag-iingat ng mga protina ng IZUMO sa mga mammal, reptile, at amphibian ay nagmumungkahi na ang kanilang potensyal na pag-andar ay naaayon sa iba pang kilalang mga protina na nauugnay sa gamete-fusion, tulad ng DCST1/2, SOF1, at FIMP.
Diagram ng arkitektura ng domain ng superfamily ng IST, na may 4HB, bisagra, at tulad ng Ig na mga domain na naka-highlight sa orange, berde, at asul, ayon sa pagkakabanggit.Ang IZUMO4 ay may natatanging rehiyon ng C-terminal na mukhang itim.Ang nakumpirma at putative na disulfide bond ay ipinapakita ng solid at tuldok na mga linya, ayon sa pagkakabanggit.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-FEM95), atAlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) ay ipinapakita sa parehong hanay ng kulay tulad ng panel A. Ang mga disulfide bond ay ipinapakita sa magenta.Hindi ipinapakita ang TMEM95, IZUMO2 at IZUMO3 transmembrane helice.
Hindi tulad ng protina ng IZUMO, ang iba pang mga protina ng SPACA (ibig sabihin, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, at SPACA9) ay inaakalang naiiba sa istruktura mula sa SPACA6 (Fig. S12).Ang SPACA9 lang ang may 4HB, ngunit hindi ito inaasahang magkakaroon ng parehong parallel-anti-parallel na oryentasyon o kaparehong disulfide bond gaya ng SPACA6.Ang SPACA1 lang ang may katulad na Ig-like na domain.Hinulaan ng AlphaFold na ang SPACA3, SPACA4 at SPACA5 ay may ganap na naiibang istraktura kaysa sa SPACA6.Kapansin-pansin, kilala rin ang SPACA4 na gumaganap ng isang papel sa pagpapabunga, ngunit sa mas malaking lawak kaysa sa SPACA6, sa halip ay pinapadali ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng tamud at oocyte zona pellucida52.
Nakahanap ang aming paghahanap sa AlphaFold ng isa pang tugma para sa IZUMO1 at SPACA6 4HB, TMEM95.Ang TMEM95, isang solong sperm-specific na transmembrane na protina, ay ginagawang baog ang mga lalaking daga kapag na-ablated ang 32,33.Ang Spermatozoa na kulang sa TMEM95 ay may normal na morphology, motility, at ang kakayahang tumagos sa zona pellucida at magbigkis sa lamad ng itlog, ngunit hindi maaaring mag-fuse sa oocyte membrane.Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang TMEM95 ay nagbabahagi ng pagkakatulad sa istruktura sa IZUMO133.Sa katunayan, kinumpirma ng modelong AlphaFold na ang TMEM95 ay isang 4HB na may parehong pares ng mga CXXC motif bilang IZUMO1 at SPACA6 at ang parehong karagdagang disulfide bond sa pagitan ng mga helice 1 at 2 na matatagpuan sa SPACA6 (Fig. 3a at S11).Bagaman ang TMEM95 ay kulang sa isang domain na tulad ng Ig, mayroon itong isang rehiyon na may pattern ng disulfide bond na katulad ng mga rehiyon ng bisagra ng SPACA6 at IZUMO1 (Fig. 3b).Sa oras ng paglalathala ng manuskrito na ito, iniulat ng preprint server ang istruktura ng TMEM95, na nagpapatunay sa resulta ng AlphaFold53.Ang TMEM95 ay halos kapareho sa SPACA6 at IZUMO1 at ebolusyonaryong natipid na sa mga amphibian (Larawan 4 at S13).
Ginamit ng paghahanap ng PSI-BLAST ang mga database ng NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, at SOF1 upang matukoy ang posisyon ng mga sequence na ito sa puno ng buhay.Hindi ipinapakita sa sukat ang mga distansya sa pagitan ng mga branch point.
Ang kapansin-pansing pangkalahatang pagkakapareho sa istruktura sa pagitan ng SPACA6 at IZUMO1 ay nagmumungkahi na sila ay nagtatag ng mga miyembro ng isang conserved structural superfamily na kinabibilangan ng TMEM95 at IZUMO 2, 3, at 4 na protina.mga kilalang miyembro: IZUMO1, SPACA6 at TMEM95.Dahil iilan lamang sa mga miyembro ang nagtataglay ng mga domain na tulad ng Ig, ang tanda ng superfamily ng IST ay ang 4HB domain, na may mga natatanging tampok na karaniwan sa lahat ng mga protina na ito: 1) Coiled 4HB na may mga helice na nakaayos sa isang anti-parallel/parallel alternation (Fig . 5a), 2) ang bundle ay may tatsulok na mukha na binubuo ng dalawang helice sa loob ng bundle at pangatlong vertical helix (Fig. key area (Fig. 5c). Ang CXXC motif, na matatagpuan sa thioredoxin-like proteins, ay kilala na gumagana. bilang redox sensor 54,55,56 , habang ang motif sa mga miyembro ng pamilya ng IST ay maaaring iugnay sa mga protein disulfide isomerases gaya ng ERp57 sa gamete fusion. Ang mga tungkulin ay nauugnay 57,58.
Ang mga miyembro ng IST superfamily ay tinukoy ng tatlong katangian ng domain ng 4HB: apat na helice na nagpapalit sa pagitan ng parallel at antiparallel na oryentasyon, ba-triangular helical bundle na mukha, at isang ca CXXC double motif na nabuo sa pagitan ng maliliit na molekula.) N-terminal helixes (orange) at hinge region β-hairpin (berde).
Dahil sa pagkakatulad sa pagitan ng SPACA6 at IZUMO1, nasubok ang kakayahan ng dating mag-bind sa IZUMO1 o JUNO.Ang biolayer interferometry (BLI) ay isang kinetic-based na paraan ng pagbubuklod na dati nang ginamit upang mabilang ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng IZUMO1 at JUNO.Pagkatapos ng incubation ng biotin-labeled sensor na may IZUMO1 bilang pain na may mataas na konsentrasyon ng JUNO analyte, isang malakas na signal ang nakita (Fig. S14a), na nagsasaad ng binding-induced na pagbabago sa kapal ng biomaterial na nakakabit sa tip ng sensor.Mga katulad na signal (ibig sabihin, ang JUNO na isinama sa sensor bilang pain laban sa IZUMO1 analyte) (Fig. S14b).Walang nakitang signal noong ginamit ang SPACA6 bilang isang analyte laban sa sensor-bound IZUMO1 o sensor-bound JUNO (Larawan S14a, b).Ang kawalan ng signal na ito ay nagpapahiwatig na ang extracellular domain ng SPACA6 ay hindi nakikipag-ugnayan sa extracellular domain ng IZUMO1 o JUNO.
Dahil ang BLI assay ay batay sa biotinylation ng libreng lysine residues sa bait protein, ang pagbabagong ito ay maaaring maiwasan ang pagbubuklod kung ang lysine residues ay kasangkot sa pakikipag-ugnayan.Bilang karagdagan, ang oryentasyon ng nagbubuklod na kamag-anak sa sensor ay maaaring lumikha ng mga steric na hadlang, kaya ang mga maginoo na pull-down na assay ay isinagawa din sa mga recombinant na SPACA6, IZUMO1 at JUNO ectodomain.Sa kabila nito, ang SPACA6 ay hindi namuo sa Kanyang-tag na IZUMO1 o Kanyang-tag na JUNO (Fig. S14c,d), na nagpapahiwatig na walang pakikipag-ugnayan na naaayon sa naobserbahan sa mga eksperimento sa BLI.Bilang isang positibong kontrol, kinumpirma namin ang pakikipag-ugnayan ng JUNO na may label na Kanyang IZUMO1 (Mga Figure S14e at S15).
Sa kabila ng pagkakatulad ng istruktura sa pagitan ng SPACA6 at IZUMO1, ang kawalan ng kakayahan ng SPACA6 na itali si JUNO ay hindi nakakagulat.Ang ibabaw ng IZUMO1 ng tao ay may higit sa 20 nalalabi na nakikipag-ugnayan sa JUNO, kabilang ang mga nalalabi mula sa bawat isa sa tatlong rehiyon (bagaman ang karamihan sa kanila ay matatagpuan sa rehiyon ng bisagra) (Fig. S14f).Sa mga nalalabi na ito, isa lamang ang natipid sa SPACA6 (Glu70).Habang maraming nalalabi na pagpapalit ang nagpapanatili ng kanilang orihinal na biochemical na katangian, ang mahahalagang Arg160 residue sa IZUMO1 ay pinalitan ng negatibong sisingilin na Asp148 sa SPACA6;ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang mutation ng Arg160Glu sa IZUMO1 ay halos ganap na tinanggal ang pagbubuklod sa JUNO43.Bilang karagdagan, ang pagkakaiba sa oryentasyon ng domain sa pagitan ng IZUMO1 at SPACA6 ay makabuluhang nadagdagan ang surface area ng JUNO-binding site ng katumbas na rehiyon sa SPACA6 (Fig. S14g).
Sa kabila ng kilalang pangangailangan para sa SPACA6 para sa gamete fusion at ang pagkakatulad nito sa IZUMO1, ang SPACA6 ay hindi lumilitaw na may katumbas na JUNO binding function.Samakatuwid, hinahangad naming pagsamahin ang aming data sa istruktura na may katibayan ng kahalagahan na ibinigay ng evolutionary biology.Ang pagkakahanay ng pagkakasunud-sunod ng mga homologue ng SPACA6 ay nagpapakita ng pag-iingat ng karaniwang istraktura na lampas sa mga mammal.Halimbawa, ang mga nalalabi sa cysteine ​​ay naroroon kahit sa mga amphibian na malayong nauugnay (Larawan 6a).Gamit ang ConSurf server, maramihang sequence alignment retention data ng 66 sequence ang na-map sa SPACA6 surface.Ang ganitong uri ng pagsusuri ay maaaring magpakita kung aling mga nalalabi ang natipid sa panahon ng ebolusyon ng protina at maaaring magpahiwatig kung aling mga rehiyon sa ibabaw ang gumaganap ng isang papel sa paggana.
isang Sequence alignment ng SPACA6 ectodomains mula sa 12 iba't ibang species na inihanda gamit ang CLUSTAL OMEGA.Ayon sa pagsusuri ng ConSurf, ang mga pinakakonserbatibong posisyon ay minarkahan ng asul.Ang mga labi ng cysteine ​​ay naka-highlight sa pula.Ang mga hangganan ng domain at mga elemento ng pangalawang istraktura ay ipinapakita sa tuktok ng alignment, kung saan ang mga arrow ay nagpapahiwatig ng mga β-strand at ang mga alon ay nagpapahiwatig ng mga helice.Ang NCBI Access Identifiers na naglalaman ng mga pagkakasunud-sunod ay: tao (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), capuchin monkey (Cebus mimic, XP_017359366), kabayo (Equus caballus oxp202_02_02_2020, XP_021821277) 3 XP_032_034) .), tupa (Ovis aries, XP_014955560), elepante (Loxodonta africana, XP_010585293), aso (Canis lupus familyis, XP_025277208), mouse (Mus musculus, NP_001156381), Tascomanian devil (S30156381) ypus, 8) , 61_89 at Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Ang pagnunumero ay batay sa pagkakasunud-sunod ng tao.b Surface na representasyon ng istraktura ng SPACA6 na may 4HB sa itaas at tulad ng Ig na domain sa ibaba, mga kulay batay sa mga pagtatantya ng konserbasyon mula sa ConSurf server.Ang pinakamahusay na napanatili na mga bahagi ay nasa asul, ang katamtamang napreserbang mga bahagi ay puti, at ang hindi gaanong napanatili ay nasa dilaw.lilang cysteine.Tatlong mga patch sa ibabaw na nagpapakita ng mataas na antas ng proteksyon ay ipinapakita sa inset na may label na mga patch 1, 2 at 3. Ang isang 4HB cartoon ay ipinapakita sa inset sa kanang tuktok (parehong scheme ng kulay).
Ang istraktura ng SPACA6 ay may tatlong lubos na natipid na mga rehiyon sa ibabaw (Larawan 6b).Ang Patch 1 ay sumasaklaw sa 4HB at sa hinge region at naglalaman ng dalawang conserved CXXC disulfide bridges, isang Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 hinge network (Fig. S7), at tatlong conserved outer aromatic residues (Phe31, Tyr73, Phe137)).isang mas malawak na gilid ng Ig-like domain (Fig. S6e), na kumakatawan sa ilang positibong sisingilin na residues sa ibabaw ng tamud.Kapansin-pansin, ang patch na ito ay naglalaman ng isang antibody epitope na dati nang ipinakita na nakakasagabal sa SPACA6 30 function.Ang Rehiyon 3 ay sumasaklaw sa bisagra at isang bahagi ng parang Ig na domain;ang rehiyong ito ay naglalaman ng mga conserved proline (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) at nakaharap sa labas na polar/charged residues.Nakakagulat, ang karamihan sa mga nalalabi sa ibabaw ng 4HB ay lubos na nagbabago (Larawan 6b), bagaman ang fold ay pinananatili sa buong SPACA6 homologue (tulad ng ipinahiwatig ng konserbatismo ng hydrophobic bundle core) at lampas sa superfamily ng IST.
Bagaman ito ang pinakamaliit na rehiyon sa SPACA6 na may pinakamakaunting nakikitang mga elemento ng pangalawang istraktura, maraming mga labi ng rehiyon ng bisagra (kabilang ang rehiyon 3) ay lubos na napangalagaan sa mga homologue ng SPACA6, na maaaring magpahiwatig na ang oryentasyon ng helical bundle at β-sandwich ay gumaganap ng isang papel.bilang isang konserbatibo.Gayunpaman, sa kabila ng malawak na hydrogen bonding at electrostatic network sa hinge na rehiyon ng SPACA6 at IZUMO1, ang katibayan ng intrinsic flexibility ay makikita sa pagkakahanay ng maraming pinapayagang istruktura ng IZUMO137,43,44.Ang pagkakahanay ng mga indibidwal na domain ay nag-overlap na mabuti, ngunit ang oryentasyon ng mga domain na nauugnay sa bawat isa ay nag-iiba mula 50° hanggang 70° mula sa gitnang axis (Fig. S16).Upang maunawaan ang conformational dynamics ng SPACA6 sa solusyon, isinagawa ang mga eksperimento ng SAXS (Fig. S17a, b).Ab initio reconstruction ng SPACA6 ectodomain conformed sa isang rod crystal structure (Fig. S18), kahit na ang Kratky plot ay nagpakita ng ilang antas ng flexibility (Fig. S17b).Ang conformation na ito ay kaibahan sa IZUMO1, kung saan ang hindi nakatali na protina ay nagpapalagay ng hugis ng boomerang kapwa sa sala-sala at sa solusyon43.
Upang partikular na matukoy ang nababaluktot na rehiyon, isinagawa ang hydrogen-deuterium exchange mass spectroscopy (H-DXMS) sa SPACA6 at inihambing sa data na dati nang nakuha sa IZUMO143 (Larawan 7a,b).Ang SPACA6 ay malinaw na mas nababaluktot kaysa sa IZUMO1, bilang ebidensya ng mas mataas na palitan ng deuterium sa buong istraktura pagkatapos ng 100,000 s ng palitan.Sa parehong mga istraktura, ang C-terminal na bahagi ng rehiyon ng bisagra ay nagpapakita ng mataas na antas ng palitan, na malamang na nagbibigay-daan sa limitadong pag-ikot ng 4HB at tulad ng Ig na mga domain na nauugnay sa isa't isa.Kapansin-pansin, ang C-terminal na bahagi ng SPACA6 hinge, na binubuo ng 147CDLPLDCP154 na nalalabi, ay isang lubos na konserbadong rehiyon 3 (Fig. 6b), na posibleng nagpapahiwatig na ang interdomain flexibility ay isang evolutionarily conserved na tampok ng SPACA6.Ayon sa pagsusuri ng flexibility, ipinakita ng CD thermal melt data na ang SPACA6 (Tm = 51.2°C) ay hindi gaanong matatag kaysa sa IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (Fig. S1e at S19).
isang H-DXMS na larawan ng SPACA6 at b IZUMO1.Ang porsyento ng palitan ng deuterium ay natukoy sa ipinahiwatig na mga punto ng oras.Ang mga antas ng pagpapalitan ng hydrogen-deuterium ay ipinapahiwatig ng kulay sa isang gradient scale mula sa asul (10%) hanggang pula (90%).Ang mga itim na kahon ay kumakatawan sa mga lugar ng mataas na palitan.Ang mga hangganan ng 4HB, bisagra at tulad ng Ig na domain na sinusunod sa istraktura ng kristal ay ipinapakita sa itaas ng pangunahing pagkakasunud-sunod.Ang mga antas ng palitan ng Deuterium sa 10 s, 1000 s, at 100,000 s ay na-plot sa isang strip chart na nakapatong sa mga transparent na molekular na ibabaw ng SPACA6 at IZUMO1.Ang mga bahagi ng mga istruktura na may deuterium exchange level na mas mababa sa 50% ay may kulay na puti.Ang mga lugar na higit sa 50% H-DXMS exchange ay may kulay sa isang gradient scale.
Ang paggamit ng CRISPR/Cas9 at mouse gene knockout na mga genetic na diskarte ay humantong sa pagkakakilanlan ng ilang salik na mahalaga para sa sperm at egg binding at fusion.Bukod sa mahusay na nailalarawan na pakikipag-ugnayan ng istraktura ng IZUMO1-JUNO at CD9, karamihan sa mga protina na nauugnay sa gamete fusion ay nananatiling istruktura at functionally enigmatic.Ang biophysical at structural characterization ng SPACA6 ay isa pang piraso ng adhesion/fusion molecular puzzle sa panahon ng fertilization.
Ang SPACA6 at iba pang miyembro ng superfamily ng IST ay lumilitaw na lubos na pinangangalagaan sa mga mammal gayundin sa mga indibidwal na ibon, reptilya, at amphibian;sa katunayan, inaakala na ang SPACA6 ay kinakailangan pa nga para sa pagpapabunga sa zebrafish 59. Ang pamamahagi na ito ay katulad ng iba pang kilalang mga protina na nauugnay sa gamete fusion tulad ng DCST134, DCST234, FIMP31, at SOF132, na nagmumungkahi na ang mga salik na ito ay kulang sa HAP2 (din kilala bilang GCS1) na mga protina na responsable para sa catalytic na aktibidad ng maraming protista., halaman, at arthropod.Fertilized fusion proteins 60, 61. Sa kabila ng malakas na pagkakatulad ng istruktura sa pagitan ng SPACA6 at IZUMO1, ang knockout ng mga gene na naka-encode sa alinman sa mga protina na ito ay nagresulta sa kawalan ng katabaan sa mga lalaking daga, na nagpapahiwatig na ang kanilang mga function sa gamete fusion ay hindi nadoble..Sa mas malawak na paraan, wala sa mga kilalang protina ng tamud na kinakailangan para sa yugto ng pagdirikit ng pagsasanib ay kalabisan.
Ito ay nananatiling isang bukas na tanong kung ang SPACA6 (at iba pang mga miyembro ng superfamily ng IST) ay lumahok sa mga intergametic junction, bumubuo ng mga intragametic network upang mag-recruit ng mga mahahalagang protina sa mga fusion point, o marahil ay kumikilos bilang mga mailap na fusogens.Ang mga pag-aaral ng co-immunoprecipitation sa HEK293T cells ay nagsiwalat ng isang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng buong haba na IZUMO1 at SPACA632.Gayunpaman, ang aming mga recombinant na ectodomain ay hindi nakikipag-ugnayan sa vitro, na nagmumungkahi na ang mga pakikipag-ugnayan na nakikita sa Noda et al.ay parehong tinanggal sa konstruksyon (tandaan ang cytoplasmic tail ng IZUMO1, na ipinakita na hindi kailangan para sa pagpapabunga62).Bilang kahalili, ang IZUMO1 at/o SPACA6 ay maaaring mangailangan ng mga partikular na binding environment na hindi namin ginagawa sa vitro, gaya ng mga physiologically specific na conformation o molecular complex na naglalaman ng iba pang mga protina (kilala o hindi pa natuklasan).Bagaman ang IZUMO1 ectodomain ay pinaniniwalaan na namamagitan sa attachment ng spermatozoa sa itlog sa perivitelline space, ang layunin ng SPACA6 ectodomain ay hindi malinaw.
Ang istraktura ng SPACA6 ay nagpapakita ng ilang natipid na mga ibabaw na maaaring kasangkot sa mga pakikipag-ugnayan ng protina-protina.Ang conserved na bahagi ng hinge region na kaagad na katabi ng CXXC motif (itinalagang Patch 1 sa itaas) ay may ilang nakaharap sa labas na aromatic residues na kadalasang nauugnay sa hydrophobic at π-stacking na mga interaksyon sa pagitan ng mga biomolecules.Ang malalawak na panig ng Ig-like domain (rehiyon 2) ay bumubuo ng isang positively charged groove na may mataas na conserved Arg at His residues, at ang mga antibodies laban sa rehiyong ito ay dati nang ginamit upang harangan ang gamete fusion 30 .Kinikilala ng antibody ang linear epitope 212RIRPAQLTHRGTFS225, na mayroong tatlo sa anim na residue ng arginine at lubos na nakatipid sa His220.Hindi malinaw kung ang dysfunction ay dahil sa pagbara ng mga partikular na nalalabi o sa buong rehiyon.Ang lokasyon ng puwang na ito malapit sa C-terminus ng β-sandwich ay nagpapahiwatig ng mga pakikipag-ugnayan ng cis sa mga kalapit na protina ng tamud, ngunit hindi sa mga protina ng oocyte.Higit pa rito, ang pagpapanatili ng isang lubos na nababaluktot na proline-rich tangle (site 3) sa loob ng bisagra ay maaaring ang site ng isang pakikipag-ugnayan ng protina-protina o, mas malamang, ay nagpapahiwatig ng pagpapanatili ng kakayahang umangkop sa pagitan ng dalawang domain.Mahalaga ang kasarian para sa hindi alam na papel ng SPACA6.pagsasanib ng mga gametes.
Ang SPACA6 ay may mga katangian ng mga intercellular adhesion protein, kabilang ang Ig-like β-sandwich.Maraming malagkit na protina (hal., cadherin, integrins, adhesins, at IZUMO1) ang nagtataglay ng isa o higit pang β-sandwich na mga domain na nagpapalawak ng mga protina mula sa cell membrane hanggang sa kanilang mga target sa kapaligiran63,64,65.Ang mala-Ig na domain ng SPACA6 ay naglalaman din ng motif na karaniwang makikita sa β-sandwich ng adhesion at cohesion: mga doublet ng parallel strands sa dulo ng β-sandwich, na kilala bilang mechanical clamp66.Ito ay pinaniniwalaan na ang motif na ito ay nagdaragdag ng paglaban sa mga puwersa ng paggugupit, na mahalaga para sa mga protina na kasangkot sa mga intercellular na pakikipag-ugnayan.Gayunpaman, sa kabila ng pagkakatulad na ito sa mga adhesin, kasalukuyang walang katibayan na ang SPACA6 ay nakikipag-ugnayan sa mga puti ng itlog.Ang SPACA6 ectodomain ay hindi makagapos sa JUNO, at ang SPACA6-expressing HEK293T cells, tulad ng ipinapakita dito, ay halos hindi nakikipag-ugnayan sa mga oocytes na kulang sa zona 32 .Kung ang SPACA6 ay nagtatatag ng mga intergametic bond, ang mga pakikipag-ugnayan na ito ay maaaring mangailangan ng mga post-translational na pagbabago o maging matatag ng iba pang mga sperm protein.Bilang suporta sa huling hypothesis, ang IZUMO1-deficient spermatozoa ay nagbubuklod sa mga oocytes, na nagpapakita na ang mga molekula maliban sa IZUMO1 ay kasangkot sa gamete adhesion step 27 .
Maraming viral, cellular, at developmental fusion protein ang may mga katangian na hinuhulaan ang kanilang paggana bilang fusogens.Halimbawa, ang viral fusion glycoproteins (mga klase I, II at III) ay mayroong hydrophobic fusion peptide o loop sa dulo ng protina na ipinasok sa host membrane.Ang hydrophilicity na mapa ng IZUMO143 at ang istraktura (tinukoy at hinulaang) ng IST superfamily ay hindi nagpakita ng maliwanag na hydrophobic fusion peptide.Kaya, kung ang anumang mga protina sa superfamily ng IST ay gumaganap bilang mga fusogens, ginagawa nila ito sa paraang naiiba sa iba pang mga kilalang halimbawa.
Sa konklusyon, ang mga pag-andar ng mga miyembro ng IST superfamily ng mga protina na nauugnay sa gamete fusion ay nananatiling isang nakakaakit na misteryo.Ang aming nailalarawan na SPACA6 recombinant molecule at ang nalutas nitong istraktura ay magbibigay ng pananaw sa mga ugnayan sa pagitan ng mga nakabahaging istrukturang ito at ang kanilang papel sa gamete attachment at fusion.
Ang pagkakasunud-sunod ng DNA na naaayon sa hinulaang ectodomain ng SPACA6 ng tao (NCBI accession number NP_001303901.1; residues 27–246) ay na-optimize ng codon para sa pagpapahayag sa mga cell ng Drosophila melanogaster S2 at na-synthesize bilang isang fragment ng gene na may pagkakasunud-sunod na pag-encode ng Kozak (Eurofins Genomics)., ang signal ng pagtatago ng BiP at ang kaukulang 5′ at 3′ ay nagtatapos para sa ligation-independent cloning ng gene na ito sa isang pMT expression vector batay sa isang metallothionein promoter na binago para sa pagpili na may puromycin (pMT-puro).Ang pMT-puro vector ay nag-encode ng isang thrombin cleavage site na sinusundan ng isang 10x-His C-terminal tag (Figure S2).
Ang matatag na paglipat ng SPACA6 pMT-puro vector sa mga selulang D. melanogaster S2 (Gibco) ay isinagawa nang katulad ng protocol na ginamit para sa IZUMO1 at JUNO43.Ang mga cell ng S2 ay lasaw at lumaki sa daluyan ng Schneider (Gibco) na dinagdagan ng panghuling konsentrasyon ng 10% (v/v) heat-inactivated fetal calf serum (Gibco) at 1X antimycotic antibiotic (Gibco).Ang mga cell ng maagang pagpasa (3.0 x 106 na mga cell) ay nilagyan ng mga indibidwal na balon ng 6-well plate (Corning).Pagkatapos ng 24 na oras ng pagpapapisa ng itlog sa 27 ° C, ang mga cell ay inilipat na may halo ng 2 mg ng SPACA6 pMT-puro vector at Effectene transfection reagent (Qiagen) ayon sa protocol ng tagagawa.Ang mga nailipat na cell ay natupok sa loob ng 72 oras at pagkatapos ay inani ng 6 mg/ml puromycin.Ang mga cell ay pagkatapos ay ihiwalay mula sa kumpletong daluyan ng Schneider at inilagay sa serum na libreng Insect-XPRESS medium (Lonza) para sa malakihang produksyon ng protina.Ang isang 1 L batch ng S2 cell culture ay pinalaki sa 8-10 × 106 ml-1 na mga cell sa isang 2 L ventilated flat-bottomed polypropylene Erlenmeyer flask at pagkatapos ay isterilisado na may panghuling konsentrasyon na 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) at sterile na na-filter.sapilitan.Ang sapilitan kultura ay incubated sa 27 ° C. sa 120 rpm para sa apat na araw.
Ang nakakondisyon na medium na naglalaman ng SPACA6 ay nahiwalay sa pamamagitan ng centrifugation sa 5660×g sa 4°C na sinusundan ng isang Centramate tangential flow filtration system (Pall Corp) na may 10 kDa MWCO membrane.Ilapat ang concentrated medium na naglalaman ng SPACA6 sa isang column na 2 ml Ni-NTA agarose resin (Qiagen).Ang Ni-NTA resin ay hinugasan ng 10 column volumes (CV) ng buffer A at pagkatapos ay 1 CV ng buffer A ay idinagdag upang magbigay ng panghuling konsentrasyon ng imidazole na 50 mM.Ang SPACA6 ay pinahiran ng 10 ml ng buffer A na dinagdagan ng imidazole sa isang pangwakas na konsentrasyon na 500 mM.Ang restriction class thrombin (Millipore Sigma) ay direktang idinagdag sa dialysis tubing (MWCO 12-14 kDa) sa 1 unit kada mg SPACA6 kumpara sa 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 at 150 mM NaCl (buffer B) para sa dialysis.) sa 4°C sa loob ng 48 oras.Ang thrombin-cleaved SPACA6 ay pagkatapos ay diluted ng tatlong beses upang mabawasan ang konsentrasyon ng asin at na-load sa isang 1 ml MonoS 5/50 GL cation exchange column (Cytiva/GE) na equilibrate na may 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.Ang cation exchanger ay hugasan ng 3 CV ng 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, pagkatapos ang SPACA6 ay na-eluted na may linear gradient na 0 hanggang 500 mM NaCl sa 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 para sa 25 CV.Pagkatapos ng chromatography ng palitan ng ion, ang SPACA6 ay naka-concentrate sa 1 ml at na-eluted na isocratically mula sa isang ENrich SEC650 10 x 300 column (BioRad) na na-equilibrate sa buffer B. Ayon sa chromatogram, pool at concentrate fraction na naglalaman ng SPACA6.Ang kadalisayan ay kinokontrol ng Coomassie-stained electrophoresis sa isang 16% SDS-polyacrylamide gel.Ang konsentrasyon ng protina ay binibilang sa pamamagitan ng pagsipsip sa 280 nm gamit ang Beer-Lambert law at ang teoretikal na molar extinction coefficient.
Ang purified SPACA6 ay na-dialyze nang magdamag laban sa 10 mM sodium phosphate, pH 7.4 at 150 mM NaF at natunaw sa 0.16 mg/mL bago ang pagsusuri ng CD spectroscopy.Ang spectral scan ng mga CD na may wavelength na 185 hanggang 260 nm ay nakolekta sa isang Jasco J-1500 spectropolarimeter gamit ang quartz cuvettes na may 1 mm optical path length (Helma) sa 25°C sa bilis na 50 nm/min.Ang CD spectra ay naitama sa baseline, na-average ng higit sa 10 mga pagkuha, at na-convert sa mean residual ellipticity (θMRE) sa mga degree cm2/dmol:
kung saan ang MW ay ang molekular na timbang ng bawat sample sa Da;Ang N ay ang bilang ng mga amino acid;Ang θ ay ang ellipticity sa mildegrees;d ay tumutugma sa haba ng optical path sa cm;konsentrasyon ng protina sa mga yunit.