310 10*1mm Stainless steel coiled tubing chemical component , Ang mga N-terminal na domain ng spidroin ay bumubuo ng mga hydrogels batay sa amyloid fibrils at nagbibigay ng platform para sa immobilization ng protina.

Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Gumagamit ka ng bersyon ng browser na may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Bilang karagdagan, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipinapakita namin ang site na walang mga istilo at JavaScript.
Mga slider na nagpapakita ng tatlong artikulo sa bawat slide.Gamitin ang likod at susunod na mga pindutan upang lumipat sa mga slide, o ang mga pindutan ng slide controller sa dulo upang lumipat sa bawat slide.

Pagtutukoy

310 10*1mm Hindi kinakalawang na asero nakapulupot na mga supplier ng tubing

Komposisyong kemikal

Mga Katangiang Mekanikal

Ang recombinant spider silk proteins (spider silk proteins) ay may maraming potensyal na aplikasyon sa pagbuo ng mga bagong biomaterial, ngunit ang kanilang multimodal at aggregation-prone na kalikasan ay nagpapahirap sa kanila na makuha at madaling gamitin.Dito naiulat namin na ang mga recombinant na miniature na spidrin na protina at, mahalaga, ang N-terminal domain (NT) mismo ay mabilis na bumubuo ng self-supporting at transparent hydrogels sa 37 °C.fusion proteins na binubuo ng NT at green fluorescent protein o purine nucleoside phosphorylase ay bumubuo ng fully functional fusion protein.Mga hydrogel.Ang aming mga resulta ay nagpapakita na ang mga recombinant na NT at fusion protein ay nagbibigay ng mataas na expression yield at nagbibigay ng mga hydrogels na may mga kaakit-akit na katangian tulad ng transparency, gelation nang walang crosslinking, at direktang immobilization ng mga aktibong protina sa mataas na density.
Ang mga gagamba ay may kasing dami ng pitong magkakaibang hanay ng mga glandula ng sutla, bawat isa ay gumagawa ng isang partikular na uri ng sutla.Ang lahat ng pitong species ng sutla ay binubuo ng mga spider silk proteins (spidroins) na humigit-kumulang 6000 residues ang haba at naglalaman ng malaking central repeat region na napapalibutan ng spherical N- at C-terminal domains (NT at CT)1,2.Ang pinaka-tinatanggap na pinag-aralan na uri ng sutla, ang pangunahing ampulla, ay ginawa ng pangunahing ampulla gland.Sa glandula na ito, ang isang monolayer ng mga epithelial cells ay nagsi-synthesize ng mga protina ng spidroin at inilalabas ang mga ito sa lumen ng glandula, kung saan naroroon ang mga ito sa isang natutunaw na anyo (doping) sa napakataas na konsentrasyon (30-50% w/v)3,4.Ang organisasyon at conformation ng mga pangunahing ampullar spidroin proteins sa gland ay pinagtatalunan, ngunit karamihan sa mga eksperimentong ebidensya ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng isang pangkalahatang helical at/o random na helical conform at micellar o lamellar na istruktura5,6,7,8,9,10.Habang ang mga paulit-ulit na domain ay kinokontrol ang mga mekanikal na katangian ng mga hibla ng sutla, na bumubuo ng β-sheet nanocrystals at amorphous na mga istruktura11,12,13,14,15, ang mga end domain ay nag-regulate ng mga hibla ng sutla bilang tugon sa pagbabago ng mga kondisyon sa kahabaan ng silk gland16,17,18.Sa pamamagitan ng pagkontrol sa pagbuo ng sutla, 19. Ang mga terminal domain ay ebolusyonaryong pinananatili at ang kanilang paggana ay maaaring karaniwan sa lahat ng mga protina ng spidrin 2,20,21.Sa pagdaan sa glandula, ang pH ng spidroin ay bumababa mula sa humigit-kumulang 7.6 hanggang <5.716 at tumataas sa paggugupit at pag-inat na pinapamagitan ng paggalaw sa unti-unting pagkipot ng duct.Sa solusyon, ang CT ay isang α-helical constitutive parallel dimer17, ngunit bilang tugon sa mababang pH at shear forces, ang CT ay nagbubukas at nagpapalit ng β-layers16, 17, na posibleng mag-trigger ng mga β-layer sa mga paulit-ulit na rehiyon ng Convert 16. Ang NT ay monomeric sa ilalim mga kondisyon na sumasalamin sa mga kondisyon sa lumen ng glandula at nagpapagitna sa solubility ng spidroin, ngunit sa pinababang pH, ang protonation ng isang bilang ng mga side chain ng carboxylic acid ay humahantong sa dimerization ng NT na may pKa na humigit-kumulang 6.5, sa gayon ay nagpapatatag ng NT at nag-aayos ng spidroin sa malaking dami.mga network16,18.Kaya, ang NT ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa pagbuo ng filament, na nagbabago mula sa isang monomer sa patong sa isang dimer sa fiber23,24,25.Ang NT ay nananatiling lubos na natutunaw at helical sa ilalim ng lahat ng mga kondisyon na pinag-aralan hanggang sa petsa16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, na nagbigay inspirasyon sa pag-unlad nito bilang isang label na nagpapahusay ng solubility para sa paggawa ng mga heterologous na protina.
Ang recombinant mini spider silk protein, na binubuo ng isang NT, isang maikling repeat region, isang CT, at isang His6 tag (His-NT2RepCT) para sa purification, ay natutunaw sa aqueous buffer gaya ng native spider silk protein at ginagaya ang mga katutubong mahalagang katangian ng silk spider .saklaw 25.31.Ang kanyang-NT2RepCT ay maaaring i-spun sa tuluy-tuloy na mga hibla gamit ang isang biomimetic machine kung saan ang isang pH 8 na natutunaw na patong ay na-extruded sa isang pH 525,32,33,34,35 na paliguan ng tubig.Ang bioreactor fermentation ng E. coli na nagpapahayag ng Kanyang-NT2RepCT at ang kasunod na post-treatment ay nagresulta sa >14 g/L na ani pagkatapos ng purification.Ang mataas na ani, mataas na solubility, at sapat na tugon ng His-NT2RepCT sa mga acidic na kondisyon ay iniuugnay lahat sa NT23, 25, 34.
Dito naiulat namin ang mabilis na pagbuo ng mga transparent na hydrogel mula sa mga recombinant na protina ng spidroin, kabilang ang NT lamang, sa pamamagitan ng pagpapapisa ng isang solusyon sa protina sa 37 ° C.Gamit ang thioflavin T fluorescence (ThT), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) at transmission electron microscopy (TEM), nalaman namin na ang NT at microspider proteins ay sumasailalim sa structural transformation sa β-sheets at amyloid-like fibrils kapag nabuo ang mga gel.Bilang karagdagan, ang mga fusion protein ng NT at green fluorescent protein (GFP) o purine nucleoside phosphorylase (PNP) ay bumubuo ng mga hydrogel na may mga fully functional na fusion fragment.Ang high-throughput na expression sa mga heterologous na host, kasama ng mabilis na pagbuo ng mga hydrogel sa ilalim ng mga kondisyong pisyolohikal, ay nagbubukas ng posibilidad ng cost-effective na produksyon ng mga hydrogel na may mga engineered na function.
Hindi tulad ng karamihan sa mga naiulat na recombinant spidrin proteins36, ang His-NT2RepCT ay stable sa Tris-HCl buffer sa pH 8 at maaaring ma-concentrate hanggang 500 mg/mL nang walang precipitation25.Samakatuwid, nagulat kami nang malaman na ang protina na ito ay mabilis na bumubuo ng optically clear, self-supporting hydrogels kapag natupok sa 37°C (Fig. 1b-d).Ang mga karagdagang pag-aaral ay nagpakita na ang His-NT2RepCT gelation ay naganap sa isang malawak na hanay ng mga konsentrasyon ng protina (10–300 mg/mL) at ang konsentrasyon na ito ay inversely na nakakaugnay sa oras ng gelation (Larawan 1c at Karagdagang Fig. 1).Upang malaman kung aling mga bahagi ng His-NT2RepCT ang namamagitan sa pagbuo ng hydrogel, pagkatapos ay sinuri namin ang bawat domain nang paisa-isa at sa iba't ibang mga kumbinasyon gamit ang isang flask inversion assay (Larawan 1a, b).Ang lahat ng nasubok na mga praksyon ng recombinant spidroin ay nabuo ng mga gel (sa isang konsentrasyon ng protina na 300 mg / mL) sa mas mababa sa 1 h, maliban sa precipitated 2Rep (Fig. 1b).Iminumungkahi nito na ang NT at CT lamang, sa kumbinasyon, o nauugnay sa mga pag-uulit, ay maaaring mag-gel sa 37°C at ang His6 tag ay hindi makakaapekto sa prosesong ito sa anumang makabuluhang lawak.Dahil sa karaniwang paniwala na ang NT ay isang lubos na natutunaw at matatag na protina, at ang mga naunang ulat ng recombinant spidroin hydrogels ay nag-uugnay ng mga epekto ng gelation sa mga pagbabago sa conformational sa mga umuulit na rehiyon at/o mga CT, ang NT mismo ay maaaring.Ang pagtuklas ng gelation ay hindi inaasahan.Karagdagang Talahanayan 1) 37, 38, 39. Kapansin-pansin, na-gel na ang NT sa loob ng 10 minuto sa konsentrasyon na ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Ang mga eksperimento sa inversion ng vial na may iba't ibang mga konsentrasyon ng NT ay nagpakita na sa> 50 mg / mL ang solusyon ng NT ay mas mabilis na nag-gel kaysa sa His-NT2RepCT sa kaukulang konsentrasyon (w / v, Figure 1c).
Ang eskematiko na representasyon ng iba't ibang mga konstruksyon ng spidroin na pinag-aralan sa gawaing ito.b Ang oras ng gel sa 37 °C para sa iba't ibang mga recombinant na protina ng spidroin (300 mg/mL) na na-verify sa pamamagitan ng pag-invert ng vial.CT gel kaagad nang walang incubation (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, 5 mm scale).c Gel oras ng His-NT2RepCT at NT sa ipinahiwatig na mga konsentrasyon ng protina sa 37 ° C.d Mga larawan ng His-NT2RepCT at NT hydrogels na may spider at ang letrang "NT" na naka-print sa ilalim, ayon sa pagkakabanggit (parehong 200 mg/mL, scale bar 5 mm).
Ang mga hydrogel na nabuo sa pamamagitan ng iba't ibang mga recombinant na protina ng spidroin ay may bahagyang magkakaibang kulay, at ang pagmamasid sa mata ay nagpapakita ng iba't ibang antas ng transparency (Larawan 1b).Ang mga NT gel ay napakalinaw habang ang ibang mga gel ay nagiging malabo.Ang kanyang-NT2RepCT at NT gels na inihagis sa cylindrical tubes ay maaaring alisin mula sa amag na buo (Larawan 1d).
Upang masubukan kung ang natural na spider silk coatings gel sa ilalim ng mga kundisyong natagpuan na ngayon na magdulot ng gelation ng mga recombinant na protina ng spidroin, ang mga coatings ay kinolekta mula sa malaking ampulla gland ng Swedish bridge spider (Larinioides sclopetarius).Ang mga coatings ay nakaimbak sa 20 mM Tris-HCl buffer sa 50 mg / mL (batay sa sinusukat na dry weight), ngunit walang gelation ang naobserbahan sa panahon ng 21 araw na incubation sa 37 ° C (Karagdagang Larawan 2a).
Upang mabilang ang mga gel na ito, ang mga rheological na sukat ay maaaring gamitin upang pag-aralan ang proseso ng gelation at matukoy ang pangkalahatang mga mekanikal na katangian.Sa partikular, ang pagsubaybay sa modulus ng imbakan (elasticity) sa matataas na temperatura ay maaaring magbigay ng impormasyon sa temperatura ng gelling pati na rin ang mga viscoelastic na katangian ng coating.Ang mga eksperimento sa pagtaas ng temperatura (gamit ang 1°C/min sa 25-45°C, batay sa mga nakaraang pag-aaral gamit ang mga natural na solusyon sa stock ng sutla)40,41 ay nagpakita na ang storage moduli ng His-NT2RepCT at NT na mga solusyon ay tumaas sa pagtaas ng temperatura .ay nadagdagan (Larawan 2 at Karagdagang Larawan. 3).Kapansin-pansin, ang NT module ay nagsimulang lumaki sa isang mas mababang temperatura kumpara sa His-NT2RepCT, naaayon sa mas mabilis na oras ng gel na naobserbahan kapag ang NT ay direktang natupok sa His-NT2RepCT sa 37 ° C (Larawan 1).Matapos ang kasunod na pagbaba ng temperatura, ang modulus ng imbakan ay hindi bumalik sa mas mababang mga halaga at nanatili sa itaas ng modulus ng pagkawala (tingnan ang Karagdagang Fig. 3), na nagpapahiwatig ng thermally irreversible stable gelation.Pagkatapos ng gelation, ang pangwakas na elastic modulus ay mula 15 hanggang 330 kPa para sa His-NT2RepCT hydrogels sa konsentrasyon na 100-500 mg/mL, at ang panghuling elastic modulus para sa NT hydrogels (100-500 mg/mL) ay mula 2 hanggang 1400 kPa (Fig. , 2 at kumpletong ramp data) tingnan ang Karagdagang Fig. 3).
a Pagbabago sa temperatura habang sinusukat ang His-NT2RepCT (300 mg/mL) at b NT (300 mg/mL) na may pag-alog.Ang mga arrow ay nagpapahiwatig ng trend ng temperatura, at ang mas magaan na pagtatabing ng data ng module ng imbakan ay naglalarawan ng pagsubok sa mas mababang mga halaga ng metalikang kuwintas para sa instrumento kaysa sa tinukoy ng tagagawa, na siyang sanhi ng tumaas na ingay.c End-module accumulation ng His-NT2RepCT at NT pagkatapos ng mataas na temperatura (100, 300, at 500 mg/mL).Ang lahat ng mga pagbabasa ng module ay kinukuha sa dalas ng 0.1 Hz.
Bilang isang potensyal na pamamaraan para sa pagsisiyasat ng mga pagbabago sa conformational na nauugnay sa gelation, naitala namin ang FTIR spectra ng His-NT2RepCT at NT bago at pagkatapos ng gelation sa 37 ° C (Larawan 3a, b).Tulad ng inaasahan, ang spectra ng His-NT2RepCT at NT na mga solusyon ay tumutugma sa mga protina na nagpapakita ng α-helix/random coil pangalawang istraktura, na may binibigkas na banda sa 1645 cm-1.Para sa parehong hydrogels, ang gelation ay nagresulta sa pagbuo ng dalawang braso sa gitnang I band sa humigit-kumulang 1617 cm-1 at 1695 cm-1 (Larawan 3a, b), na nagpapahiwatig ng pagbuo ng mga antiparallel β-sheet na istruktura.Ang mga pagbabagong ito ay maaari ding malinaw na makikita sa kani-kanilang pangalawang derivative at pagkakaiba ng gelation spectra (Karagdagang Fig. 4b).Ang dalawang banda ng NT β-layer ay mas binibigkas kaysa sa His-NT2RepCT, na nagpapahiwatig na ang kabuuang nilalaman ng mga β-layer band sa NT hydrogel ay mas mataas kaysa sa NT2RepCT hydrogel.
isang FTIR absorption spectra ng His-NT2RepCT at b NT (parehong 500 mg/mL) bago (solusyon) at pagkatapos ng (gel) incubation sa 37°C.c TEM na mga larawan ng nasuspinde na 50 mg/ml na NT2RepCT gel at d NT.Scale bar 200 nm.e Fiber diameters ng His-NT2RepCT at NT hydrogels.n = 100 sinusukat na fibrils, p <0.0001.Ang mga error bar ay nagpapakita ng karaniwang paglihis.Ang gitna ng mga error bar ay ang ibig sabihin.Isang walang paired na t-test (two-tailed) ang ginamit para sa statistical analysis.f ThT fluorescence ng iba't ibang recombinant spidroin proteins (100 mg/mL) sa 37 °C nang walang nanginginig.g NT (100 mg/mL) inoculation experiments mula sa 100 mg/mL NT gel na may 0%, 5%, 10%, at 20% na buto.
Ang pagsusuri sa gel gamit ang transmission electron microscopy (TEM) ay nagpakita na ang hydrogel ay binubuo ng amyloid-like fibrils (Fig. 3c, 3d).Ang mga fibril na nabuo sa NT ay pinahaba (5–12 nm ang lapad) at walang sanga, habang ang His-NT2RepCT fibrils ay mas maikli ang haba at makabuluhang mas malawak ang diameter (7–16 nm) (Fig. 3e).Ang mga resulta na ito ay nagpapahintulot sa amin na sundin ang mga kinetics ng fibrosis gamit ang thioflavin T (ThT) assay.Para sa lahat ng mga recombinant na protina ng spidroin, tumaas ang fluorescent signal kapag na-incubate ang mga sample sa 37 °C (Larawan 3f, Pandagdag na Larawan 5a).Alinsunod sa paghahanap na ito, ang mikroskopikong pagsusuri ng NT at His-NT2RepCT sa ilalim ng mga kondisyon ng gelling ay nagsiwalat ng isang pare-parehong pagtaas sa ThT fluorescence nang walang kapansin-pansing lokal na akumulasyon ng ThT-positive aggregates (Karagdagang Fig. 5b, c).Ang pagbuo ng ThT-positive fibrils ay hindi sinamahan ng pagtaas sa NT at His-NTCT turbidity (Karagdagang Fig. 5d), na nangangahulugan na ang isang network ng mga fibrils sa gel ay maaaring mabuo nang hindi nakompromiso ang kalinawan ng gel.Ang paghahasik sa pamamagitan ng pagdaragdag ng maliit na halaga ng pre-formed fibrils ay maaaring makabuluhang mapabilis ang fibril formation ng ilang amyloids42,43,44 ngunit pagdaragdag ng 5%, 10% o 20% (w/w) NT sa isang solusyon ng NT hydrocoagulants.seeding effect (Larawan 3g).Marahil ito ay dahil sa ang katunayan na ang mga fibril sa hydrogel ay medyo naayos at hindi maaaring gamitin bilang mga buto.
Ang hindi inaasahang pag-uugali ng mga recombinant na protina ng spidroin sa mataas na temperatura ay nag-udyok sa karagdagang pag-aaral ng spectroscopy ng nuclear magnetic resonance (NMR) upang matukoy ang mga pagbabago sa conformational na nauugnay sa pagbuo ng gel.Ang NMR spectra ng His-NT2RepCT na mga solusyon na naitala sa paglipas ng panahon sa 37°C ay nagpakita na ang CT ay bahagyang nakatiklop, samantalang ang NT at 2Rep signal ay nawala (Larawan 4a), na nagmumungkahi na ito ay pangunahin sa NT at 2Rep na bahagyang kinokontrol ang pagbuo ng His- NT2RepCT hydrogel.Ang signal ng CT ay pinahina din sa 20% ng orihinal na intensity nito, na nagmumungkahi na ang CT ay halos naayos din at isinama sa istraktura ng hydrogel.Para sa isang mas maliit na bahagi ng CT, na kung saan ay kasing-mobile tulad ng sa preincubated sample at sa gayon ay sinusunod ng solusyon na NMR, ang spectra ay kulang ng mga signal para sa unang 10 structured residues, posibleng dahil sa mahirap na immobilization ng naka-attach na bahagi ng His-NT2Rep.Ang spectra ng NMR ng -state ng hydrogels -NT2RepCT ay nagsiwalat ng nangingibabaw na presensya ng α-helice at β-layer at, sa mas mababang lawak, ang random coil conformation (Fig. 4b).Ang pagtatasa ng chemical shift ng mga residue ng methionine na naroroon lamang sa NT ay nagpakita na ang domain na ito ay na-convert sa isang istraktura ng β-sheet.Ang time-dependent spectra ng NT sa solusyon ay nagpakita ng pare-parehong pagbaba ng signal intensity (Fig. 4c), at ang solid-state na NMR ng NT hydrogels ay nagpakita na karamihan sa mga residue ng NT ay na-convert sa β-sheet structures (Fig. 4d).Hindi matukoy nang hiwalay ang conformation ng 2Rep dahil sa tendency nitong magsama-sama.Gayunpaman, ang solid state NMR spectra ng NTCT at His-NT2RepCT hydrogels ay halos magkapareho (Larawan 4b; Karagdagang Fig. 6b), na nagmumungkahi na ang 2Rep ay nag-ambag ng kaunti sa istrukturang bahagi ng His-NT2RepCT hydrogel.Para sa CT hydrogels, α-helice, β-sheet, at random helical secondary structures ay natagpuang umiiral (Karagdagang Fig. 6d).Iminumungkahi nito na ang ilang bahagi ng CT ay nananatiling α-helice habang ang iba ay nagiging β-sheet.Kaya, ang mga resulta ng NMR spectroscopy ay nagmumungkahi na ang NT ay mahalaga para sa pagbuo ng hydrogel at nagbabago din sa isang β-sheet conformation sa pagsasanib sa 2Rep at CT.Alinsunod dito, natagpuan namin kamakailan na ang amyloid spatial zippers ay malamang na mabuo sa lahat ng limang helices ng NT domain, at ang Waltz algorithm ay hinulaang isang amyloidogenic na rehiyon sa helix 1 (Fig. 4e).
2D spectra ng 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT solution bago (asul) at 19 na oras pagkatapos ng incubation (pula) sa 37°C.Ang mga indibidwal na cross peak sa pulang spectrum at F24, G136, polyA sa asul na spectrum ay tinutukoy ng solong titik na mga simbolo ng amino acid at mga natitirang numero.Ipinapakita ng mga inset ang pag-asa ng intensity ng signal sa oras para sa mga napiling residue mula sa NT, 2Rep, at CT na mga domain.b Solid-state radiofrequency (RFDR) spectra ng His-NT2RepCT hydrogels.Ang mga ugnayan ng mga residue ng Cα/Cβ na naobserbahan sa spectra ng RFDR ay natutukoy sa pamamagitan ng paghahambing sa mga pagbabago ng kemikal ng peptide ng modelo at mga halaga na nagmula sa mga istatistika82,83 at ang kanilang mga pangalawang istruktura.SSB – umiikot na sideband.c One-dimensional spectra ng 15N-HSQC 10 mg/mL NT solution sa panahon ng incubation sa 37 °C sa loob ng 36 na oras.Ipinapakita ng inset ang volumetric intensity laban sa oras.d Solid state RFDR spectra ng NT hydrogels.Ang mga ugnayan ng mga nalalabi ng Cα / Cβ at ang kanilang pangalawang istruktura na sinusunod sa spectra ng RFDR ay ipinahiwatig.e Batay sa NT45.79 fibrillation propensity profile mula sa Zipper database (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Ang Rosetta energy ng spatial lightning shift window ng hexapeptide ay ipinapakita sa kcal/mol.Ang mga pulang bar ay tumutukoy sa mga hexapeptides na may mataas na fibrosis propensity (enerhiya ng Rosetta sa ibaba -23 kcal/mol; sa ibaba ng tuldok na linya).Ang mga berdeng bar ay nagpapahiwatig ng mga fragment na may Rosetta energies sa itaas ng threshold at samakatuwid ay mas malamang na bumuo ng mga steric na zipper.Ang mga fragment na naglalaman ng proline ay hindi kasama sa pagsusuri (nang walang mga haligi).Ang mga parisukat ay nagpapahiwatig ng mga lugar ng amyloidosis na hinulaang ng Waltz algorithm81 (https://waltz.switchlab.org).Ang pagkakasunud-sunod ng mga residue ng amino acid ng NT ay nasa itaas, at ang mga uri ng mga residu na matatagpuan sa pangalawang istraktura ng β (tinutukoy ng solid-state NMR spectroscopy) ay ipinapakita sa pula.Ang mga posisyon ng limang NT α-helice ay itinalaga bilang (H1-H5)28.
Sa pH <6.5, nagdimerize ang HT, na lumalaban sa denaturation na dulot ng init o urea18.Upang maipaliwanag kung paano nakakaapekto ang dimerization at stability ng NT sa gelation, ang mga solusyon na naglalaman ng 100 mg/ml NT ay kinokontrol sa pH 8, 7, at 6 gamit ang vial inversion test.Ang mga sample ng NT na incubated sa pH 8 at 7 ay naka-gel pagkatapos ng 30 min sa 37 °C, ngunit ang pH 8 gel ay nanatiling malinaw, habang ang pH 7 gel ay nagpakita ng nakikitang precipitate (Fig. 5a).Sa kaibahan, ang isang solusyon na naglalaman ng HT sa pH 6 ay hindi nakabuo ng isang gel, at ang isang malaking precipitate ay makikita pagkatapos ng 20 min sa 37 ° C.Iminumungkahi nito na ang mga dimer mismo at/o ang kanilang mas mataas na katatagan kumpara sa mga monomer ay pumipigil sa gelation.Ang pagbuo ng isang precipitate para sa NT sa pH 7 at 6 ay hindi inaasahan, dahil naiulat na ang NT ay natutunaw sa 200 mg/ml27, madaling refold pagkatapos ng heat denaturation, at pinapanatili din ang isang α-helix sa mas mababang halaga ng pH 18. Ang isang malamang na paliwanag para sa mga pagkakaibang ito ay ang naunang naiulat na mga eksperimento ay isinagawa sa temperatura ng silid o mas mababa, o sa medyo mababa ang konsentrasyon ng protina16,18,19.
NT vial inversion test (100 mg/mL) sa pH 8, 7, 6 at 154 mM NaCl (pH 8) pagkatapos ng incubation sa 37°C.b NT CD spectra na may at walang 154 mM NaF at 154 mM NaCl, ayon sa pagkakabanggit.Ang molar ellipticity sa 222 nm ay na-convert sa isang proporsyon ng natural na fold.c NT inversion assay (100 mg/mL) NT* (37 °C at 60 °C), NTA72R (37 °C), at His-NT-L6 (37 °C at 60 °C).d CD spectra ng NT mutants NT*, NTA72R, at His-NT-L6.Ang molar ellipticity sa 222 nm ay na-convert sa isang proporsyon ng natural na fold.e Inversion test ng NTFlSp, NTMiSp at pinababang NTMiSp (100 mg/mL).Scale bar 5 mm.f CD spectra ng NT, NTFlSp, NTMiSp at pinababang NTMiSp.Ang molar ellipticity sa 222 nm ay na-convert sa isang proporsyon ng natural na fold.Ang buong NT spectra sa 25 °C at 95 °C ay ipinapakita sa Karagdagang Larawan 8.
Tinutukoy ng konsentrasyon ng physiological salt ang mga electrostatic na interaksyon sa pagitan ng mga subunit ng NT at dimerization ng paglipat ng NT sa mas mababang pH18.Natagpuan namin na ang pagkakaroon ng 154 mM NaCl at NaF ay talagang pumipigil sa gelation, ayon sa pagkakabanggit (Larawan 5a, b; Karagdagang Fig. 2b) at ang mga asing-gamot na ito ay nagpapataas ng thermal stability ng NT monomer (Larawan 5b, Pandagdag na Larawan 8) .Iminumungkahi din nito na ang pagpapahusay ng katatagan, sa halip na dimerization, ay pumipigil sa pagbuo ng gel.
Upang higit pang tuklasin ang papel ng dimerization ng protina at katatagan sa gelation, gumamit kami ng dalawang mutant, NT* at NTA72R, na nananatiling monomeric din sa mababang pH28.30.Ang NT* ay isang double charge reversal mutant kung saan ang maliwanag na dipolar charge distribution ng monomer ay na-flatten, na pumipigil sa dimerization at lubhang nagpapataas ng monomer stability.Ang NTA72R ay isang naka-charge na dipole, ngunit ang Arg-substituted Ala ay matatagpuan sa hangganan ng dimer, kaya ang mga mutasyon ay nakakasagabal sa mga interaksyon ng subunit na kinakailangan para sa dimerization.Sa pagpapapisa ng itlog sa 37 ° C, ang NT * ay hindi nakabuo ng isang hydrogel, habang ang NTA72R ay nakabuo ng isang opaque gel sa loob ng 15 min (Larawan 5c).Dahil ang parehong NT* at NTA72R ay hindi maaaring dimerize ngunit naiiba sa monomer stability (Fig. 5d), ang mga resulta ay mariing iminumungkahi na ang mataas na thermodynamic stability ay pumipigil sa NT mula sa gelling.Sinusuportahan din ito ng katotohanan na ang HT* ay bumubuo ng isang gel kapag ito ay hindi matatag sa mataas na temperatura (pagkatapos ng 8 min sa 60 ° C; Fig. 5c).Nauna nang ipinakita na ang mataas na nilalaman ng methionine sa NT ay nagpapatunaw sa natural na pagtitiklop nito at ang anim na Met to Leu na mga pamalit (tinukoy dito bilang His-NT-L6) ay malakas na nagpapatatag sa NT46 monomer.Batay sa palagay na ang kakayahang umangkop sa istruktura ay kinakailangan para sa pagbuo ng NT gel, nalaman namin na ang His-NT-L6 stable mutant ay hindi nag-gel sa 37 ° C (Larawan 5c, d).Gayunpaman, ang His-NT-L6 ay nabuo din ng isang gel sa pagpapapisa ng itlog sa 60 ° С para sa 60 min (Larawan 5c).
Ang kakayahan ng NT na mag-transform sa mga istrukturang β-sheet at bumuo ng mga hydrogel ay lumilitaw na naaangkop sa ilan ngunit hindi lahat ng mga domain ng NT ng spidroin.Ang mga NT mula sa iba't ibang uri ng sutla at species ng spider, Trichonephila clavipes (NTFlSp), ay bumubuo ng mga gel sa kabila ng kanilang medyo mababang nilalaman ng methionine at mataas na thermal stability (Larawan 5e, f at Karagdagang Talahanayan 2).Sa kaibahan, ang NT mula sa maliit na ampullar protein spidroin mula sa Araneus ventricosus (NTMiSp) na may mababang thermal stability at mataas na nilalaman ng methionine ay hindi nakabuo ng mga hydrogels (Karagdagang Talahanayan 2 at Fig. 5e, f).Ang huli ay maaaring nauugnay sa pagkakaroon ng intramolecular disulfide bonds29,47.Sa pare-pareho, kapag nabawasan ang disulfide bond ng NTMiSp, nabuo ito ng hydrogel pagkatapos ng incubation sa 37°C sa loob ng 10 min (Fig. 5e).Sa konklusyon, dapat tandaan na ang kakayahang umangkop sa istruktura ay isang mahalaga, ngunit hindi lamang, criterion para sa pagbuo ng isang gel mula sa NT.Ang isa pang kadahilanan na maaaring may kaugnayan ay ang propensidad na bumuo ng amyloid fibrils, at ang pagsusuri sa database ng zipper at ang Waltz algorithm ay nagpakita ng ugnayan sa pagitan ng kakayahang bumuo ng mga gel at ang pagkakaroon ng mga amyloidogenic na rehiyon, pati na rin ang lawak ng mga hinulaang rehiyon. upang bumuo ng steric zippers.Nagkaroon ng ugnayan (Karagdagang Talahanayan 2 at Karagdagang Fig. 9).
Ang kakayahan ng NT na bumuo ng mga fibril at bumuo ng mga gel sa ilalim ng mga paborableng kondisyon ay humantong sa amin na mag-hypothesize na ang mga pagsasanib ng NT kasama ng iba pang mga fragment ng protina ay maaari pa ring bumuo ng mga gel na may ganap na paggana ng mga kasosyo sa pagsasani.Upang subukan ito, ipinakilala namin ang berdeng fluorescent protein (GFP) at purine nucleoside phosphorylase (PNP) sa C-terminus ng NT, ayon sa pagkakabanggit.Ang mga nagresultang fusion protein ay ipinahayag sa E. coli na may napakataas na huling ani (150 mg/L at 256 mg/L shake flask culture para sa His-NT-GFP at His-NT-PNP, ayon sa pagkakabanggit), na naaayon sa ipinakita. para sa Iba pang mga protina na pinagsama sa NT Ref.30. Ang kanyang-NT-GFP (300mg/mL) at His-NT-PNP (100mg/mL) na mga fusion protein ay nabuo ang mga gel pagkatapos ng 2 oras at 6.5 na oras sa 37°C at, mahalaga, ang bahagi ng GFP ay nanatiling hindi nagbabago.naobserbahan pagkatapos ng gelation, na may> 70% ng paunang fluorescence intensity na natitira pagkatapos ng gelation (Fig. 6a).Upang masukat ang aktibidad ng PNP sa kanyang mga solusyon at gels-NT-PNP, kinailangan naming palabnawin ang fusion protein sa NT dahil ang aktibidad ng enzymatic ng purong paghahanda ay nasa labas ng hanay ng pagtuklas ng assay sa mga konsentrasyon ng gelling.Ang gel na nabuo na may halo na naglalaman ng 0.01 mg/mL His-NT-PNP at 100 mg/mL NT ay nagpapanatili ng 65% ng paunang aktibidad ng enzymatic ng mga preincubated na sample (Fig. 6b).Ang gel ay nanatiling buo sa panahon ng pagsukat (Karagdagang Fig. 10).
isang Relative fluorescence intensity bago at pagkatapos ng gelation ng His-NT-GFP (300 mg/mL) at inverted vial na naglalaman ng His-NT-GFP hydrogel (300 mg/mL) sa ilalim ng nakikita at UV light.Ang mga puntos ay nagpapakita ng mga indibidwal na sukat (n = 3), ang mga error bar ay nagpapakita ng karaniwang paglihis.Ang average na halaga ay ipinapakita sa gitna ng mga error bar.b Ang aktibidad ng PNP ay nakuha sa pamamagitan ng fluorometric analysis gamit ang mga solusyon at gel na binubuo ng NT (100 mg/ml) at isang halo na naglalaman ng 0.01 mg/ml his-NT-PNP at 100 mg/ml New Taiwan dollars.Ang inset ay nagpapakita ng inverted vial na naglalaman ng hydrogel na naglalaman ng His-NT-PNP (5 mm scale bar).
Dito, naiulat namin ang pagbuo ng mga hydrogel mula sa NT at iba pang mga recombinant na protina ng spidroin sa pamamagitan ng pagpapapisa ng isang solusyon sa protina sa 37 ° C (Larawan 1).Ipinakita namin na ang gelation ay nauugnay sa pagbabagong-anyo ng α-helice sa β-layer at ang pagbuo ng amyloid-like fibrils (Fig. 3 at 4).Ang paghahanap na ito ay nakakagulat dahil ang mga NT ay nakapulupot na globular na limang-helix na bundle na kilala sa kanilang napakataas na solubility at mataas na katatagan sa mga konsentrasyon >200 mg/mL sa 4°C sa loob ng ilang araw27.Bilang karagdagan, ang mga NT ay madaling refold pagkatapos ng denaturation ng init sa mababang konsentrasyon ng protina sa µM.Ayon sa aming mga resulta, ang pagbuo ng fibril ay nangangailangan ng kumbinasyon ng >10 mg/mL na konsentrasyon ng protina at bahagyang nakataas na temperatura (Larawan 1).Ito ay naaayon sa ideya na ang amyloid fibrils ay maaaring mabuo mula sa mga globularly folded na protina na nasa isang bahagyang nakabukang estado dahil sa thermal fluctuations sa ilalim ng physiological na kondisyon 48 .Ang mga halimbawa ng mga protina na sumasailalim sa conversion na ito ay kinabibilangan ng insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin at lysozyme51,52,53.Bagama't ang NT ay isang α-helix sa katutubong estado nito, humigit-kumulang 65% ng polypeptide chain ay tugma sa steric zipper formation (Fig. 4e) 45 .Dahil ang monomer ay dynamic na mobile46, maaari nitong ilantad ang mga potensyal na amyloidogenic na rehiyon sa moderately elevated na temperatura at sa mataas na konsentrasyon ng kabuuang protina ay maaaring umabot sa isang kritikal na konsentrasyon para sa amyloid fibril formation54.Kasunod ng pangangatwiran na ito, natagpuan namin ang isang negatibong ugnayan sa pagitan ng konsentrasyon ng spidroin at oras ng gelation (Fig. 1c), at kung ang monomeric NT conformation ay nagpapatatag alinman sa pamamagitan ng mga mutasyon (NT*, His-NT-L6) o sa pamamagitan ng pagdaragdag ng asin, ay maaaring maiwasan ang pagbuo ng mga hydrogel (Larawan 5).
Sa karamihan ng mga kaso, ang mga amyloid fibril ay nawawala mula sa solusyon bilang isang namuo, ngunit sa ilalim ng ilang mga kundisyon maaari silang bumuo ng mga hydrogel55,56,57.Ang mga hydrogel-forming fibrils ay karaniwang may mataas na aspect ratio at bumubuo ng matatag na tatlong-dimensional na network sa pamamagitan ng molecular entanglement, 55,58 na naaayon sa aming mga resulta.Para sa pagbuo ng hydrogel sa vitro, ang mga protina ay madalas na buo o bahagyang nabubuksan, halimbawa, sa pamamagitan ng pagkakalantad sa mga organikong solvent, mataas na temperatura (70–90°C) at/o mababang pH (1.5–3.0)59,60,61,62.Ang mga spidroin hydrogel na inilarawan dito ay hindi nangangailangan ng malupit na pagproseso, at hindi rin nangangailangan ng mga cross-linking agent upang patatagin ang mga hydrogel.
Nauna nang naiulat na ang mga spidroin ay umuulit at ang mga QD, na lumilitaw na sumasailalim sa β-sheet switching sa panahon ng pag-ikot ng sutla, ay bumubuo ng mga hydrogel.Kung ikukumpara sa aming mga natuklasan, ang mga oras ng pagpapapisa ng itlog at / o mga temperatura ng pagpapapisa ng itlog ay mas mahaba o mas mataas, ayon sa pagkakabanggit, at ang mga nagresultang hydrogels ay madalas na opaque (Larawan 7 at Pandagdag na Talahanayan 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Bilang karagdagan sa mabilis na mga oras ng gel, ang NT hydrogels na >300 mg/mL (30%) ay nalampasan ang lahat ng iba pang inilarawan na recombinant spider silk protein hydrogels, pati na rin ang mga natural na hydrogel tulad ng gelatin, alginate (2%), agar (0.5 % ) at collagen.(0.6%) (Larawan 7 at Mga Karagdagang Talahanayan 1 at 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Ang oras ng gel at nababanat na modulus ng mga hydrogel sa pag-aaral na ito ay inihambing sa iba pang mga hydrogel na nakabatay sa spidroin at mga napiling natural na hydrogel.Ang mga sanggunian ay ibinigay kasama ng isang paglalarawan ng mga kondisyon ng gelation.APS Ammonium persulfate, temperatura ng silid.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Lumilitaw na ang mga spider ay nakagawa ng mga paraan upang maiwasan ang pag-gelling ng spidrin sa panahon ng pag-iimbak.Sa kabila ng mataas na konsentrasyon ng protina sa glandula ng sutla, ang malaking rehiyong umuulit na nauugnay sa terminal domain ay nangangahulugan na ang maliwanag na konsentrasyon ng NT at CT sa glandula ay tumutugma sa humigit-kumulang 10-20 mg/ml, sa hangganan ng pag-aaral na ito.kinakailangan para sa in vitro na sinusunod na pagbuo ng hydrogel.Bilang karagdagan, ang mga katulad na konsentrasyon ng mga asing-gamot 16 ay nagpapatatag ng NT, tulad ng sa mga glandula ng sutla (Larawan 5b).Ang NT conformation ay pinag-aralan sa E. coli cytosol at nalaman na mas mahigpit na nakatiklop kaysa kapag napagmasdan sa vitro, higit na nagpapahiwatig na ang asin o iba pang mga kadahilanan ay pumipigil sa pagsasama-sama nito sa vivo.Gayunpaman, ang kakayahan ng mga NT na magbago sa β-sheet fibrils ay maaaring mahalaga para sa pagbuo ng filament at dapat na siyasatin sa mga pag-aaral sa hinaharap.
Bilang karagdagan sa mga aspeto ng nobela ng NT-amyloid-like fibril at hydrogel formation na naobserbahan sa pag-aaral na ito, ipinapakita rin namin na ang phenomenon na ito ay maaaring may biotechnological at biomedical na aplikasyon (Fig. 8).Bilang isang patunay ng konsepto, pinagsama namin ang NT sa GFP o PNP at ipinakita na ang fusion protein ay bumubuo rin ng mga hydrogel kapag natupok sa 37 ° C at ang mga fraction ng GFP at PNP ay higit na nagpapanatili ng kanilang aktibidad pagkatapos ng gelation (Larawan 6).Ang mga nucleoside phosphorylases ay mahalagang catalysts synthesis ng nucleoside analogues75, na ginagawang nauugnay ang aming pagtuklas para sa industriya ng biopharmaceutical.Ang konsepto ng pagpapahayag ng mga fusion protein na bumubuo ng mga transparent na hydrogel sa ilalim ng paborableng mga kondisyon ay nagbibigay-daan sa paglikha ng mga functionalized na hydrogel na may mga paborableng katangian para sa isang malawak na hanay ng mga aplikasyon tulad ng enzyme immobilization, kinokontrol na paglabas ng gamot at tissue engineering.Bilang karagdagan, ang NT at NT* ay mahusay na mga marker ng expression30, na nangangahulugan na ang NT at ang mga variant nito ay maaaring gamitin para sa high-throughput na produksyon ng mga soluble fusion protein at kasunod na paglikha ng mga immobilized target na protina sa 3D hydrogels.
Ang NT ay natutunaw, α-helical at stable sa mababang konsentrasyon (µM) at 37°C.Sa parehong temperatura, ngunit sa pagtaas ng mga konsentrasyon (>10 mg/ml), ang NT ay bumubuo ng mga gel na binubuo ng amyloid-like fibrils.Ang mga NT fusion protein ay bumubuo rin ng mga fibrillar gel na may mga fully functional na fusion fragment, na nagpapahintulot sa iba't ibang mga protina na ma-immobilize sa 3D hydrogels gamit ang NT.Ibaba: NT (PDB: 4FBS) at mga paglalarawan ng mga fiber network at nauugnay na mga istruktura ng protina (pinagpalagay at hindi iginuhit sa sukat, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Ang mga konstruksyon (tingnan ang Pandagdag na Talahanayan 4 para sa isang kumpletong listahan kasama ang mga pagkakasunud-sunod ng amino acid) ay na-clone sa plasmid pT7 at binago sa E. coli BL21 (DE3).Ang E. coli na naglalaman ng mga engineered plasmids ay inoculated sa Luria broth na pupunan ng kanamycin (70 mg/l) at lumaki nang magdamag sa 30°C at 250 rpm.Ang kultura ay pagkatapos ay inoculated 1/100 sa LB medium na naglalaman ng kanamycin at kultura sa 30 ° C at 110 rpm hanggang ang OD600 ay umabot sa 0.8.Para sa mga pag-aaral ng NMR, lumaki ang bakterya sa M9 minimal medium na naglalaman ng 2 g ng D-glucose 13C (Aldrich) at 1 g ng ammonium chloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) para sa pag-label ng protina na may isotopes.Ibaba ang temperatura sa 20 degrees Celsius at himukin ang pagpapahayag ng protina na may 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (panghuling konsentrasyon).Pagkatapos ng magdamag na pagpapahayag ng protina, ang mga cell ay na-ani sa 7278 × g, 4 ° C sa loob ng 20 min.Ang mga cell pellet ay muling nasuspinde sa 20 mM Tris-HCl, pH 8, at nagyelo hanggang sa karagdagang paggamit.Ang mga natunaw na cell ay na-lysed gamit ang isang cell disruptor (TS series machine, Constant Systems Limited, England) sa 30 kPa.Pagkatapos ang mga lysate ay isinentrifuge sa 25,000 g sa loob ng 30 minuto sa 4 ° C.Para sa NTMiSp, ang pellet ay muling sinuspinde sa 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, at na-sonicated sa loob ng 2 min (2 s on/off, 65%), pagkatapos ay isinentripuga muli sa 25,000 xg, 4° C. sa loob ng 30 minuto.Ang supernatant ay na-load sa isang haligi ng Ni-NTA, hinugasan ng 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, at sa wakas ang protina ay na-eluted na may 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Upang makabuo ng NT2RepCT at NTCT, thrombin digestion ay nagpapakilala sa site (ThrCleav) sa pagitan ng Kanyang at NT.Ang mga site ng thrombin cleavage ay naroroon din sa His-NT-ThrCleav-2Rep (gumagawa ng 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (gumawa ng NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (gumawa ng CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (gumawa ng NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (gumawa ng NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (gumawa ng NTF1Sp), at His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (gumawa ng NTMiSp).Ang mga konstruksyon ay hinukay gamit ang thrombin (1:1000) at na-dialyze magdamag sa 4° C. na may 20 mM Tris-HCl, pH 8, gamit ang isang Spectra/Por dialysis membrane na may molecular weight threshold na 6-8 kDa.Pagkatapos ng dialysis, ang solusyon ay ikinarga sa isang haligi ng Ni-NTA at ang effluent na naglalaman ng protina ng interes ay kinokolekta.Ang mga konsentrasyon ng protina ay tinutukoy sa pamamagitan ng pagsukat ng UV absorbance sa 280 nm gamit ang extinction coefficient ng bawat protina, maliban sa NTF1Sp, na ginamit ang Bradford assay ayon sa protocol ng tagagawa.Ang kadalisayan ay tinutukoy ng SDS polyacrylamide (4–20%) gel electrophoresis at Coomassie brilliant blue staining.Ang mga protina ay puro gamit ang mga filter ng centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) sa 4000 xg na may 10 kDa molecular weight cutoff sa 20 minutong cycle.
I-thaw ang solusyon sa protina at maingat na i-pipet ang 150 µl sa isang 1 ml na malinaw na septum vial (8 x 40 mm Thermo Scientific).Ang mga tubo ay nilagyan ng takip at tinatakan ng parafilm upang maiwasan ang pagsingaw.Ang mga sample (n = 3) ay incubated sa 37°C o 60°C at pana-panahong binabaligtad upang obserbahan ang gelation.Ang mga sample na hindi nag-gel ay incubated nang hindi bababa sa isang linggo.Bawasan ang NTMiSp disulfide bond na may 10 mM DTT bawat 10 µM na protina.Upang pag-aralan ang gelation ng natural na spider silk coatings, ang Swedish bridge spider ay pinutol, ang dalawang pangunahing ampullated glands ay inilagay sa 200 μl ng 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 at pinutol upang pahintulutan ang patong na maghiwalay mula sa mga glandula..Ang mga nilalaman ng mga glandula ay natunaw sa buffer, 50 µl para sa pagpapasiya ng tuyong timbang (sa pamamagitan ng pagpapapisa ng mga bukas na vial sa 60 °C hanggang pare-pareho ang timbang) at 150 µl para sa gelation sa 37 °C.
Ang geometry/tool ​​ng pagsukat ay gawa sa hindi kinakalawang na asero gamit ang isang parallel plate na may tuktok na diameter na 20 mm at isang puwang na 0.5 mm.Painitin ang sample mula 25 °C hanggang 45 °C at pabalik sa 25 °C sa bilis na 1 °C bawat minuto gamit ang isang hindi kinakalawang na asero sa ilalim ng Peltier plate.Ang mga pagsukat ng vibrational ay isinagawa sa dalas ng 0.1 Hz at sa linear na viscoelastic na rehiyon ng materyal sa isang strain na 5% at 0.5% para sa mga sample na 100 mg/mL at 300–500 mg/mL, ayon sa pagkakabanggit.Gumamit ng custom na humidity chamber para maiwasan ang pagsingaw.Sinuri ang data gamit ang Prism 9.
Para sa pagkolekta ng infrared (IR) spectra sa temperatura ng silid mula 800 hanggang 3900 cm–1.Ang ATR device, pati na rin ang liwanag na daanan sa pamamagitan ng spectrometer, ay nililinis ng tuyong na-filter na hangin bago at sa panahon ng eksperimento.Ang mga solusyon (500 mg / mL upang mabawasan ang mga taluktok ng pagsipsip ng tubig sa spectra) ay na-pipett sa mga kristal, at ang mga gel (500 mg / mL) ay nabuo bago ang pagsukat at pagkatapos ay inilipat sa mga kristal (n = 3).1000 scan ang naitala na may resolution na 2 cm-1 at zero duty cycle na 2. Ang pangalawang derivative ay kinakalkula gamit ang OPUS (Bruker) gamit ang isang smoothing range na siyam na puntos.Ang spectra ay na-normalize sa parehong rehiyon ng integration sa pagitan ng 1720 at 1580 cm-1 gamit ang F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".Sa ATR-IR spectroscopy, ang lalim ng pagtagos ng isang infrared beam sa isang sample ay nakadepende sa wavenumber, na nagreresulta sa mas malakas na pagsipsip sa mas mababang mga wavenumber kaysa sa mas mataas na mga wavenumber.Ang mga epektong ito ay hindi naitama para sa spectra na ipinapakita sa Fig.3 dahil napakaliit nila (Karagdagang Larawan 4).Ang nawastong spectra para sa figure na ito ay kinakalkula gamit ang Bruker OPUS software.
Sa prinsipyo, ang isang komprehensibong quantification ng mga conformation ng protina ay posible pagkatapos ng maaasahang deconvolution ng mga sangkap sa loob ng amide I peak.Gayunpaman, ang ilang mga hadlang ay lumitaw sa pagsasanay.Ang ingay sa spectrum ay maaaring lumabas bilang (false) peak sa panahon ng deconvolution.Bilang karagdagan, ang peak dahil sa water bending ay tumutugma sa posisyon ng amide I peak at maaaring may katulad na magnitude para sa mga sample na naglalaman ng malaking halaga ng tubig, tulad ng aqueous gel na pinag-aralan dito.Samakatuwid, hindi namin sinubukan na ganap na mabulok ang amide I peak, at ang aming mga obserbasyon ay dapat lamang isaalang-alang bilang suporta sa iba pang mga pamamaraan tulad ng NMR spectroscopy.
Ang mga solusyon ng 50 mg/ml NT at His-NT2RepCT ay na-gelled magdamag sa 37°C.Ang hydrogel ay pagkatapos ay diluted na may 20 mM Tris-HCl (pH 8) sa isang konsentrasyon ng 12.5 mg / ml, inalog mabuti at pipetted upang masira ang gel.Susunod, ang hydrogel ay natunaw ng 10 beses na may 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl ng sample ay inilapat sa isang tansong grid na pinahiran ng formvar, at ang labis na sample ay tinanggal gamit ang blotting paper.Ang mga sample ay hinugasan ng dalawang beses na may 5 µl ng MilliQ na tubig at namantsahan ng 1% uranyl formate sa loob ng 5 minuto.Alisin ang labis na mantsa gamit ang sumisipsip na papel, pagkatapos ay tuyo sa hangin ang mata.Ang imaging ay isinagawa sa mga grid na ito gamit ang isang FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN na tumatakbo sa 100 kV.Ang mga imahe ay naitala sa x 26,500 at x 43,000 magnification gamit ang isang Veleta 2k × 2k CCD camera (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany).Para sa bawat sample (n = 1), 10-15 na mga imahe ang naitala.Ang ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ay ginamit para sa pagsusuri ng imahe at pagsukat ng mga diameter ng hibla (n = 100, iba't ibang mga hibla).Ang Prism 9 ay ginamit upang magsagawa ng mga hindi paired na t-test (two-tailed).Ang ibig sabihin ng His-NT2RepCT at NT fibrils ay 11.43 (SD 2.035) at 7.67 (SD 1.389) nm, ayon sa pagkakabanggit.Ang confidence interval (95%) ay -4.246 hanggang -3.275.antas ng kalayaan = 198, p < 0.0001.
80 µl ng mga sample ng likido na naglalaman ng 10 µM thioflavin T (ThT) ay sinusukat sa triplicate (n = 3) sa ilalim ng mga static na kondisyon gamit ang Corning 96-well black bottom clear bottom plates (Corning Glass 3881, USA).Ang mga pagkakaiba sa fluorescence ay naitala gamit ang isang 440 nm excitation filter at isang 480 nm emission filter (FLUOStar Galaxy mula sa BMG Labtech, Offenburg, Germany).Ang signal ng ThT ay hindi puspos o na-quench, dahil ang mga eksperimento na may iba't ibang mga konsentrasyon ng ThT ay isinagawa nang hindi binabago ang intensity ng signal.Itala ang absorbance sa 360 nm para sa pagsukat ng haze.Para sa mga eksperimento sa seeding, 100 mg/mL gels ay nabuo sa 37° C., muling sinuspinde, at ginamit para sa seeding sa molar ratios na 5%, 10%, at 20%.Sinuri ang data gamit ang Prism 9.
I-thaw ang mga stock ng His-NT2RepCT at NT >100 mg/mL sa yelo at i-filter sa pamamagitan ng 0.22 µm na filter.Ang mga konsentrasyon ay kinakalkula sa pamamagitan ng pagsukat ng pagsipsip sa 280 nm gamit ang Nanodrop.Sa mga balon ng isang 96-well black non-binding plate (Corning) na may malinaw na ilalim, ang mga sample ay natunaw sa 20 mg/ml sa 20 mM Tris-HCl pH 8 at hinaluan ng 5 μM ThT (huling konsentrasyon), kabuuang sample na konsentrasyon 50 μl na dami.Ang mga sample ay nakunan ng larawan tuwing 10 minuto sa 37 ° C sa isang CellObserver (Zeiss) na mikroskopyo na may transmitted light channel at FITC excitation at emission filter set para sa ThT imaging.Isang 20x/0.4 lens ang ginagamit para sa imaging.Ginamit ang Zen Blue (Zeiss) at ImageJ (https://imagej.nih.gov/) para sa pagsusuri ng imahe.Ang mga gel ay inihanda din mula sa mga solusyon sa NT at His-NT2RepCT sa isang konsentrasyon ng 50 mg / mL na naglalaman ng 20 mM Tris pH 8 at 5 μM ThT at natupok sa 37 ° C sa loob ng 90 min.Ang mga piraso ng gel ay inilipat sa isang bagong balon na naglalaman ng 20 mM Tris, pH 8, at 5 μM ThT sa isang non-binding black 96 well clear bottom plate.Kumuha ng berdeng fluorescence at maliwanag na mga larawan sa field sa 20x/0.4 magnification.Ginamit ang ImageJ para sa pagsusuri ng imahe.
Nakuha ang Solution NMR spectra sa 310 K sa isang 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer na nilagyan ng QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Mga sample ng NMR na naglalaman ng 10 mg/mL homogenous na protina na may label na 13C, 15N, natunaw sa 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Ang mga pagbabago sa kemikal ng NT2RepCT sa pH 6.7 ay ginamit upang magtalaga ng peak 23 sa 2D spectrum ng 15N-HSQC.
Ang magic angle spinning solid NMR (MAS) spectra ng 13C, 15N-labeled hydrogels ay naitala sa isang Bruker Avance III HD spectrometer sa 800 MHz na nilagyan ng 3.2 mm 13C/15N{1H} electronless probe.Ang sample na temperatura ay kinokontrol gamit ang variable temperature gas stream sa 277 K. Two-dimensional dipole rotational resonance (DARR)76 at radio frequency reconnection (RFDR)77 spectra ay nakuha sa MAS frequency na 12.5 kHz at 20 kHz, ayon sa pagkakabanggit.Ang cross polarization (CP) mula 1H hanggang 13C ay isinagawa gamit ang isang linear ramp mula 60.0 hanggang 48.0 kHz sa 1H, 61.3/71.6 kHz sa 13C (sa 12.5/20 kHz MAS) at oras ng pakikipag-ugnay 0.5–1 ms.Ang spinal6478 decoupling sa 73.5 kHz ay ​​ginamit sa pagkolekta ng data.Ang oras ng pagkuha ay 10 milliseconds at ang cycle delay ay 2.5 segundo.Ang single-linked Cα/Cβ correlations na naobserbahan sa RFDR spectra ay itinalaga batay sa katangian na residue-type na chemical shift at multiply-linked correlations sa DARR spectra.
Ang database ng Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ay ginamit upang suriin ang mga flutter tendencies at Rosetta energy para sa NT, NTFlSp, at NTMiSp.Kino-compute ng Zipper database ang Rosetta Energy80, na pinagsasama ang ilang libreng function ng enerhiya upang magmodelo at magsuri ng istruktura ng protina.Ang antas ng enerhiya na -23 kcal/mol o mas mababa ay nagpapahiwatig ng mataas na tendensya sa fibrillate.Ang mas mababang enerhiya ay nangangahulugan ng higit na katatagan ng dalawang β-strand sa conformation ng zipper.Bilang karagdagan, ang Waltz algorithm ay ginamit upang mahulaan ang mga amyloidogenic na rehiyon sa NT, NTFlSp at NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Ang NT protein solution ay hinaluan ng 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer sa pH 5.5 at 6.0 upang mapababa ang pH sa pH 6 at 7, ayon sa pagkakabanggit.Ang huling konsentrasyon ng protina ay 100 mg / ml.
Ang mga pagsukat ay isinagawa sa isang J-1500 CD spectrometer (JASCO, USA) gamit ang isang 300 μL cuvette na may optical path na 0.1 cm.Ang mga protina ay natunaw sa 10 μM (n = 1) sa 20 mM phosphate buffer (pH 8).Upang pag-aralan ang katatagan ng protina sa pagkakaroon ng asin, ang mga protina ay nasuri sa parehong konsentrasyon (n = 1) sa 20 mM phosphate buffer (pH 8) na naglalaman ng 154 mM NaF o NaCl, ayon sa pagkakabanggit.Ang mga pag-scan sa temperatura ay naitala sa 222 nm mula 25°C hanggang 95°C na may rate ng pag-init na 1°C/min.Ang proporsyon ng mga katutubong nakatiklop na protina ay kinakalkula gamit ang formula (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal).Bilang karagdagan, limang spectra ang naitala para sa bawat sample mula 260 nm hanggang 190 nm sa 25 ° C at pagkatapos ng pagpainit hanggang 95 ° C.Limang spectra ang na-average, pinakinis at na-convert sa molar ellipticity.Sinuri ang data gamit ang Prism 9.
Ang intensity ng fluorescence ng His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) ay sinusukat sa triplicate (n = 3) sa 96-well Corning plate na may itim na transparent na ilalim (Corning Glass 3881, USA) sa ilalim ng mga static na kondisyon.Sukatin ang mga sample gamit ang fluorescence-based plate reader na may excitement wavelength na 395 nm at itala ang emission sa 509 nm bago ang gelation at 2 oras mamaya sa 37°C.Sinuri ang data gamit ang Prism 9.
Ang purine nucleoside phosphorylase activity assay kit (fluorometric method, Sigma Aldrich) ay ginamit ayon sa mga tagubilin ng tagagawa.Upang sukatin ang aktibidad sa mga gel at solusyon na naglalaman ng His-NT-PNP, paghaluin ang 10 ng ng His-NT-PNP sa 100 mg/mL NT sa kabuuang volume na 2 µL dahil ang gel ay nagbigay ng senyales sa itaas ng pagitan ng pagtuklas ng set.Ang mga kontrol para sa mga gel at solusyon na walang His-NT-PNP ay kasama.Ang mga sukat ay isinagawa nang dalawang beses (n = 2).Matapos sukatin ang aktibidad, tinanggal ang pinaghalong reaksyon at kinunan ng litrato ang gel upang matiyak na ang gel ay nanatiling buo sa panahon ng pagsukat.Sinuri ang data gamit ang Prism 9.
Para sa higit pang impormasyon sa disenyo ng pag-aaral, tingnan ang abstract ng pag-aaral ng Kalikasan na naka-link sa artikulong ito.
Ang mga figure 1 at 2 ay nagpapakita ng paunang data.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, at 6, Mga Pandagdag na Fig.3, pandagdag na fig.5a, d, pandagdag na fig.6 at karagdagang fig.8. Data Ang data mula sa pag-aaral na ito ay naka-host sa Zenodo database https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Ang data ng NMR na nakuha sa pag-aaral na ito ay nai-post sa BMRBig repository sa ilalim ng entry ID bmrbig36.Ang mga istruktura ng GFP at PNP ay kinuha mula sa PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. at Johansson, J. Umiikot na artipisyal na sutla ng gagamba.Pambansang Kemikal.biology.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Itinatampok ng Nephila clavipes genome ang pagkakaiba-iba ng mga gene ng spider silk at ang kanilang kumplikadong pagpapahayag.Pambansang Genette.49, 895–903 (2017).