347 12.7*1.24mm Stainless steel coiled tubing ,Molecular mechanism ng synchronous electrostatic condensation at coaggregation ng α-synuclein at tau

Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Gumagamit ka ng bersyon ng browser na may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Bilang karagdagan, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipinapakita namin ang site na walang mga istilo at JavaScript.
Mga slider na nagpapakita ng tatlong artikulo sa bawat slide.Gamitin ang likod at susunod na mga pindutan upang lumipat sa mga slide, o ang mga pindutan ng slide controller sa dulo upang lumipat sa bawat slide.

347 Stainless Steel Pipe Detalye

347 12.7*1.24mm Hindi kinakalawang na asero nakapulupot na tubo

Labas na Diameter: 6.00 mm OD hanggang 914.4 mm OD, Mga sukat hanggang 24" NB available Ex-stock, OD Size Steel Tubes available Ex-stock

SS 347 Pipe Thickness Range: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, atbp. (0.5-12mm) O di-regular na laki na iaakma kung kinakailangan

Uri: SS 347 Seamless Pipe |SS 347 ERW Pipe |SS 347 Welded Pipe |SS 347 Mga Gawa na Pipe |SS 347 CDW Tube, LSAW Pipe / Seam-welded / Muling iginuhit

Form: SS 347 Round Pipes/ Tubes, SS 347 Square Pipes/ Tubes, SS 347 Rectangular Pipe/ Tubes, SS 347 Coiled Tubes, SS 347 "U" Shape, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Hydraulic Tubes

Haba: Single Random, Double Random & Kinakailangang Haba ng Dulo: Plain End, Beveled End, Treaded

End Protection: Mga Plastic Caps |Outside Finish: 2B, No.4, No.1, No.8 Mirror Finish para sa Stainless Steel Pipe, Tapos ayon sa Mga Kinakailangan ng customer

Kundisyon ng Paghahatid: Annealed and Pickled, Polished, Bright Annealed, Cold Drawn

Inspeksyon, Mga Ulat sa Pagsubok: Mga Sertipiko sa Pagsubok sa Mill, EN 10204 3.1, Mga Ulat sa Kemikal, Mga Ulat sa Mekanikal, Mga Ulat sa Pagsusuri ng PMI, Mga Ulat sa Visual na Inspeksyon, Mga Ulat sa Inspeksyon ng Third Party, Mga Ulat sa Inaprubahan ng NABL, Ulat sa Mapanirang Pagsubok, Mga Ulat sa Hindi Mapanirang Pagsubok

Pag-iimpake: Naka-pack sa Wooden Boxes, Plastic Bags, Steel Strips na Bundled, o ayon sa Mga Kahilingan ng Customer

Mga Espesyal: Ang mga Laki at Detalye maliban sa itaas ay maaaring gawin kapag hiniling

SS 347 Saklaw ng Sukat ng Pipe:1/2 pulgada NB, OD hanggang 24 pulgada

ASTM A312 347: Seamless at straight-seam welded austenitic pipe na nilayon para sa mataas na temperatura at pangkalahatang corrosive na serbisyo.Hindi pinahihintulutan ang filler metal sa panahon ng hinang.

ASTM A358 347: Electric fusion welded austenitic pipe para sa corrosive at/o mataas na temperatura na serbisyo.Karaniwang pipe lang na hanggang 8 pulgada ang ginagawa sa detalyeng ito.Ang pagdaragdag ng metal na tagapuno ay pinahihintulutan sa panahon ng hinang.

ASTM A790 347: Seamless at straight-seam welded ferritic/austenitic (duplex) pipe na nilayon para sa pangkalahatang corrosive na serbisyo, na may partikular na diin sa paglaban sa stress corrosion cracking.

ASTM A409 347: Straight-seam o spiral-seam electric fusion welded large diameter austenitic light-wall pipe sa mga sukat na 14" hanggang 30" na may mga pader na Sch5S at Sch 10S para sa kinakaing unti-unti at/o mataas

ASTM A376 347: Seamless austenitic pipe para sa mataas na temperatura application.

ASTM A813 347: Single-seam, single- o double-welded austenitic pipe para sa mataas na temperatura at pangkalahatang kinakaing mga aplikasyon.

ASTM A814 347: Cold-worked welded austenitic pipe para sa mataas na temperatura at pangkalahatang corrosive na serbisyo.

347H Stainless Steel Pipe Komposisyon ng Kemikal

Hindi kinakalawang na asero 347H Pipe Mechanical Properties

Hindi kinakalawang na asero 347H Pipe Pisikal na Katangian

Mga Katumbas na Grado para sa 347H Stainless Steel Pipe

Ang Amyloid alpha-synuclein (αS) aggregation ay isang tanda ng Parkinson's disease at iba pang synucleinopathies.Kamakailan lamang, ang tau protein na karaniwang nauugnay sa Alzheimer's disease ay nauugnay sa αS pathology at natagpuang co-localize sa αS-rich inclusions, kahit na ang molekular na mekanismo ng coaggregation ng dalawang protina ay nananatiling hindi maliwanag.Iniuulat namin dito na ang αS phase ay naghihiwalay sa mga likidong condensate sa pamamagitan ng electrostatic complex condensation na may positibong sisingilin na polypeptides tulad ng tau.Depende sa affinity ng αS para sa polycations at ang rate ng valence depletion ng coagulation network, ang mga clots ay sumasailalim sa mabilis na gelation o coalescence na sinusundan ng mabagal na amyloid aggregation.Sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng isang suite ng mga advanced na biophysical technique, nagawa naming makilala ang liquid-liquid αS/Tau phase separation at matukoy ang mga pangunahing salik na humahantong sa pagbuo ng mga heterogenous aggregate na naglalaman ng parehong mga protina sa isang likidong condensate ng protina.
Bilang karagdagan sa mga compartment ng lamad, ang spatial na separation sa mga cell ay maaari ding makamit sa pamamagitan ng pagbuo ng mayaman sa protina, tulad ng likidong siksik na katawan na tinatawag na biomolecular condensates o droplets, sa pamamagitan ng prosesong kilala bilang liquid-liquid phase separation (LLPS).Ang mga patak na ito ay nabuo sa pamamagitan ng mga multivalent na temporal na interaksyon, kadalasan sa pagitan ng mga protina o protina at RNA, at nagsisilbi ng iba't ibang mga function sa halos lahat ng mga buhay na sistema.Ang isang malaking bilang ng mga protina na may kakayahang LLP ay nagpapakita ng mga pagkakasunud-sunod ng mababang pagiging kumplikado na lubos na nagkakagulo sa kalikasan at sa pagbuo ng mga biomolecular condensates3,4,5.Maraming pang-eksperimentong pag-aaral ang nagsiwalat ng kakayahang umangkop, kadalasang nagkakagulo, at multivalent na katangian ng mga protina na bumubuo sa mga condensate na ito na parang likido, bagama't kakaunti ang nalalaman tungkol sa mga partikular na molecular determinant na kumokontrol sa paglaki at pagkahinog ng mga condensate na ito sa isang mas solid-like. estado..
Sinusuportahan ng bagong data ang hypothesis na ang aberrant na protein-driven na LLPS at pagbabago ng mga droplet sa solidong istruktura ay maaaring may kaugnayang mga cellular pathway na humahantong sa pagbuo ng mga hindi matutunaw na nakakalason na pinagsama-samang madalas na mga palatandaan ng mga degenerative na sakit.Maraming LLPS-associated intrinsically disordered proteins (IDPs), kadalasang mataas ang charge at flexible, ay matagal nang nauugnay sa neurodegeneration sa pamamagitan ng proseso ng amyloid aggregation.Sa partikular, ang mga biomolecular IDP condensate tulad ng FUS7 o TDP-438 o mga protina na may malalaking mababang kumplikadong mga domain tulad ng hnRNPA19 ay ipinakita sa edad sa gel-like o kahit na solidong mga form sa pamamagitan ng isang proseso na tinatawag na fluidization.tambalan.sa solid phase transition (LSPT) bilang isang function ng oras o bilang tugon sa ilang mga post-translational modification o pathologically makabuluhang mutations1,7.
Ang isa pang IDP na nauugnay sa LLPS sa vivo ay ang Tau, isang microtubule-associated disordered protein na ang amyloid aggregation ay naisangkot sa Alzheimer's disease10 ngunit kamakailan ay nasangkot din sa Parkinson's disease (PD) at iba pang synaptic nuclear proteinopathies 11, 12, 13 ay nauugnay.Ang Tau ay ipinakita na kusang humiwalay sa solusyon/cytoplasm dahil sa paborableng electrostatic na pakikipag-ugnayan14, na nagreresulta sa pagbuo ng tau-enriched droplet na kilala bilang electrostatic coacervates.Naobserbahan din na ang ganitong uri ng di-tiyak na pakikipag-ugnayan ay ang puwersang nagtutulak sa likod ng maraming biomolecular condensates sa kalikasan15.Sa kaso ng tau protein, ang electrostatic aggregation ay maaaring mabuo sa pamamagitan ng simpleng pagsasama-sama, kung saan ang magkasalungat na sisingilin na mga rehiyon ng protina ay nagpapalitaw sa proseso ng cleavage, o sa pamamagitan ng kumplikadong pagsasama-sama sa pamamagitan ng pakikipag-ugnayan sa mga negatibong sisingilin na polymer tulad ng RNA.
Kamakailan lamang, ang α-synuclein (αS), isang amyloid IDP na nasangkot sa PD at iba pang mga sakit na neurodegenerative na sama-samang kilala bilang synucleinopathy17,18, ay ipinakita sa mga modelo ng cellular at hayop19,20 na puro sa mga condensate ng protina na may pag-uugali na tulad ng likido.Ipinakita ng mga pag-aaral sa vitro na ang αS ay sumasailalim sa LLPS sa pamamagitan ng simpleng pagsasama-sama sa pamamagitan ng nakararami na hydrophobic na pakikipag-ugnayan, bagaman ang prosesong ito ay nangangailangan ng pambihirang mataas na konsentrasyon ng protina at hindi karaniwang mahabang oras ng pagpapapisa ng itlog19, 21.Kung ang mga condensate na naglalaman ng αS na naobserbahan sa vivo ay nabuo sa pamamagitan nito o iba pang mga proseso ng LLPS ay nananatiling isang pangunahing hindi nalutas na isyu.Katulad nito, kahit na ang pagsasama-sama ng αS amyloid ay na-obserbahan sa mga neuron sa PD at iba pang mga synucleinopathies, ang eksaktong mekanismo kung saan ang αS ay sumasailalim sa intracellular amyloid aggregation ay nananatiling hindi maliwanag, dahil ang labis na pagpapahayag ng protina na ito ay hindi lilitaw upang ma-trigger ang prosesong ito mismo.Ang karagdagang pinsala sa cellular ay madalas na kinakailangan, na nagmumungkahi na ang ilang mga cellular na lokasyon o microenvironment ay kinakailangan para sa renucleation ng intracellular αS amyloid assemblies.Ang isang cellular na kapaligiran na partikular na madaling kapitan ng pagsasama-sama ay maaaring ang loob ng mga condensate ng protina 23 .
Nang kawili-wili, ang αS at tau ay natagpuan na magkakasama sa pagsasama sa mga katangian ng sakit sa mga tao na may sakit na Parkinson at iba pang mga synucleinopathies 24,25 at ang mga eksperimento ay nag-ulat ng isang synergistic na pathological na relasyon sa pagitan ng dalawang protina 26,27 na nagmumungkahi ng isang potensyal na relasyon sa pagitan ng pagsasama-sama ng αS at tau sa mga sakit na neurodegenerative.sakit.Ang αS at tau ay natagpuan na nakikipag-ugnayan at nagtataguyod ng pagsasama-sama ng bawat isa sa vitro at sa vivo 28,29 at ang mga heterogenous na pinagsama-samang binubuo ng dalawang protina na ito ay naobserbahan sa utak ng mga pasyenteng may synucleinopathies 30 .Gayunpaman, kaunti ang nalalaman tungkol sa molekular na batayan ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng αS at tau at ang mekanismo ng co-aggregation nito.Ang αS ay naiulat na nakikipag-ugnayan sa tau sa pamamagitan ng isang electrostatic na atraksyon sa pagitan ng mataas na negatibong sisingilin na C-terminal na rehiyon ng αS at ang gitnang proline-rich na rehiyon ng tau, na pinayaman din sa mga nalalabi na positibong sisingilin.
Sa pag-aaral na ito, ipinapakita namin na ang αS ay maaari talagang mag-dissociate sa mga droplet sa pamamagitan ng electrostatic complex condensation sa pagkakaroon ng tau protein, kabaligtaran sa pakikipag-ugnayan nito sa iba pang positibong sisingilin na polypeptides tulad ng poly-L-lysine (pLK), at sa prosesong ito .Ang αS ay gumaganap bilang isang scaffold molecule para sa droplet network.Natukoy namin ang mga kapansin-pansin na pagkakaiba sa proseso ng pagkahinog ng electrostatic αS coacervates, na nauugnay sa mga pagkakaiba-iba sa valency at lakas ng pakikipag-ugnayan ng mga protina na kasangkot sa coacervate network.Kapansin-pansin, napagmasdan namin ang co-aggregation ng αS at tau amyloid na mga protina sa pangmatagalang likidong coacervates at natukoy ang ilang mga pangunahing kadahilanan na humahantong sa co-aggregation ng dalawang protina na ito sa naturang coacervates.Dito ay inilalarawan namin nang detalyado ang prosesong ito, na isang posibleng mekanismo ng molekular na pinagbabatayan ng colocalization ng dalawang protina sa mga pagsasama na tukoy sa sakit.
Ang αS ay may mataas na anionic na C-terminal na buntot sa neutral na pH (Fig. 1a), at na-hypothesize namin na maaari itong sumailalim sa LLPS sa pamamagitan ng condensation ng mga electrostatic complex na may polycationic disordered polypeptide molecules.Gumamit kami ng 100-residue poly-L-lysine (pLK) bilang panimulang molekula ng modelo dahil sa positibong sisingilin at hindi maayos na polymeric na kalikasan nito sa neutral na pH 32. Una, kinumpirma namin na ang pLK ay nakikipag-ugnayan sa Ct domain ng αS sa pamamagitan ng Solution NMR spectroscopy (Larawan 1b) gamit ang 13C/15N na may label na αS sa pagkakaroon ng pagtaas ng αS:pLK molar ratios.Ang pakikipag-ugnayan ng pLK sa Ct-domain ng αS ay nagpapakita ng sarili sa mga perturbations ng chemical shift at isang pagbawas sa peak intensity sa rehiyong ito ng protina.Nang kawili-wili, kapag pinaghalo namin ang αS sa pLK sa isang konsentrasyon ng αS na humigit-kumulang.5–25 µM sa pagkakaroon ng polyethylene glycol (5–15% PEG-8) (karaniwang LLPS buffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) agad kaming dumaan sa malawak na larangan ng pagbuo ng protina .Ang mga droplet ay sinusunod gamit ang fluorescence (WF) at bright-field (BF) microscopy (Fig. 1c).1-5 µm droplets na naglalaman ng concentrated αS (idinagdag ang 1 µM AlexaFluor488-labeled αS, AF488-αS), ang kanilang mga electrostatic properties ay maaaring makuha mula sa kanilang resistensya sa 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) at ang pagiging sensitibo nito sa isang pagtaas sa konsentrasyon ng NaCl (Larawan 1c).Ang mala-fluid na katangian ng mga coacervates ng αS/pLK electrostatic complex ay ipinapakita sa pamamagitan ng kanilang kakayahang mag-fuse sa loob ng milliseconds (Fig. 1d).Gamit ang turbidimetry, binibilang namin ang pagbuo ng mga droplet sa ilalim ng mga kondisyong ito, nakumpirma ang electrostatic na kalikasan ng pangunahing pakikipag-ugnayan na nauugnay sa katatagan nito (Larawan 1e), at sinuri ang epekto ng iba't ibang mga ratio ng polimer sa proseso ng LLPS (Fig. 1f).Kahit na ang pagbuo ng droplet ay sinusunod sa isang malawak na hanay ng mga ratio ng polimer, ang proseso ay napaka-kanais-nais kapag ang pLK ay labis sa αS.Naobserbahan din ang mga LLP gamit ang displacing agent na may pagkakaiba sa kemikal na dextran-70 (70 kDa) o paggamit ng iba't ibang sample na format, kabilang ang mga glass slide drop, microplate well ng iba't ibang materyales, Eppendorf o quartz capillaries.
isang Schematic na representasyon ng iba't ibang mga rehiyon ng protina sa mga variant ng WT-αS at ΔCt-αS na ginamit sa pag-aaral na ito.Ang amphipathic N-terminal domain, ang hydrophobic amyloid-forming (NAC) na rehiyon, at ang negatibong sisingilin na C-terminal na domain ay ipinapakita sa asul, orange, at pula, ayon sa pagkakabanggit.Ang Net Charge Per Residual (NCPR) na mapa ng WT-αS ay ipinapakita.b NMR analysis ng αS/pLK na pakikipag-ugnayan sa kawalan ng macromolecular clumps.Habang tumataas ang konsentrasyon ng pLK (αS:pLK molar ratios na 1:0.5, 1:1.5, at 1:10 ay ipinapakita sa light green, green, at dark green, ayon sa pagkakabanggit).c Coacervate αS/pLK (molar ratio 1:10) sa 25 µM (1 µM AF488-labeled αS o Atto647N-labeled pLK para sa WF imaging) sa LLPS buffer (itaas) o pupunan ng 500 mM NaCl (ibaba sa kaliwa) o pagkatapos ng 10 % 1,6-hexanediol (1,6-HD; kanang ibaba).Scale bar = 20 µm.d Mga kinatawan ng mikroskopikong larawan ng BF droplet fusion ng αS/pLK (molar ratio 1:10) sa konsentrasyon na 25 μM;ipinapahiwatig ng mga arrow ang pagsasama ng mga indibidwal na patak (pula at dilaw na mga arrow) sa isang bagong patak (orange na arrow) sa loob ng 200 ms) .Scale bar = 20 µm.e Light scattering (sa 350 nm) αS/pLK aggregation sa LLPS buffer bago at pagkatapos ng pagdaragdag ng 500 mM NaCl o 10% 1,6-HD sa 25 µM αS (N = 3 sample replicates, mean at standard deviation ay ipinahiwatig din).f BF image (itaas) at light scattering analysis (sa 350 nm, ibaba) ng αS/pLK aggregation sa 25 μM αS na may pagtaas ng αS:pLK molar ratio (N = 3 sample replicates, mean at standard deviation na ipinahiwatig din).Scale bar = 10 µm.Ang scale bar sa isang larawan ay nagpapahiwatig ng sukat ng lahat ng mga larawan sa isang panel.Ang raw data ay ibinibigay sa anyo ng mga raw data file.
Batay sa aming mga obserbasyon ng αS / pLK electrostatic complex condensation at mga nakaraang obserbasyon ng αS bilang isang molekula ng kliyente ng tau / RNA condensate sa pamamagitan ng direktang pakikipag-ugnayan sa tau31, na-hypothesize namin na ang αS at tau ay maaaring mag-co-segregate sa solvent sa kawalan ng RNA paghalay.sa pamamagitan ng mga electrostatic complex, at ang αS ay ang scaffold protein sa αS/Tau coacervates (tingnan ang tau charge distribution sa Figure 2e).Napansin namin na kapag ang 10 μM αS at 10 μM Tau441 (na naglalaman ng 1 μM AF488-αS at 1 μM Atto647N-Tau, ayon sa pagkakabanggit) ay pinagsama-sama sa LLPS buffer, madali silang nabuo ang mga pinagsama-samang protina na naglalaman ng parehong mga protina, tulad ng nakikita ng WF microscopy.(Larawan 2a).Ang colocalization ng dalawang protina sa mga droplet ay nakumpirma ng confocal (CF) microscopy (Karagdagang Fig. 1a).Ang katulad na pag-uugali ay naobserbahan nang ang dextran-70 ay ginamit bilang ahente ng pagsasama-sama (Karagdagang Fig. 1c).Gamit ang alinman sa FITC na may label na PEG o dextran, nalaman namin na ang parehong mga crowding agent ay pantay na ibinahagi sa mga sample, na hindi nagpapakita ng segregation o association (Karagdagang Fig. 1d).Sa halip, iminumungkahi nito na sa sistemang ito ay itinataguyod nila ang paghihiwalay ng phase sa pamamagitan ng macromolecular crowding effects, dahil ang PEG ay isang mas pinipiling stable na crowding agent, tulad ng nakikita sa iba pang mga sistema ng LLP33, 34.Ang mga droplet na mayaman sa protina na ito ay sensitibo sa NaCl (1 M) ngunit hindi sa 1,6-HD (10% v/v), na nagpapatunay sa kanilang mga electrostatic na katangian (Karagdagang Fig. 2a, b).Ang kanilang tuluy-tuloy na pag-uugali ay nakumpirma sa pamamagitan ng pagmamasid sa millisecond merging droplet event gamit ang BF microscopy (Larawan 2b).
isang Confocal (CF) microscopy na mga larawan ng αS/Tau441 ay nagsasama sa LLPS buffer (10 μM ng bawat protina, 0.5 μM ng AF488 na may label na αS at Atto647N na may label na Tau441).b Representative differential interference contrast (DIC) na mga larawan ng αS/Tau441 droplet fusion na mga kaganapan (10 μM para sa bawat protina).c Phase diagram batay sa light scattering (sa 350 nm) ng Tau441 LLPS (0–15 µM) sa kawalan (kaliwa) o presensya (kanan) ng 50 µM αS.Ang mas maiinit na mga kulay ay nagpapahiwatig ng higit na pagkalat.d Banayad na pagkalat ng mga sample ng αS/Tau441 LLPS na may pagtaas ng konsentrasyon ng αS (Tau441 sa 5 µM, N = 2–3 sample na pag-uulit gaya ng ipinahiwatig).e Schematic na representasyon ng ilang variant ng tau protein at iba't ibang rehiyon ng protina na ginamit sa pag-aaral na ito: negatibong sisingilin ang N-terminal domain (pula), proline-rich region (asul), microtubule-binding domain (MTBD, naka-highlight sa orange), at amyloid-forming pair spiral.mga rehiyon ng filament (PHF) na matatagpuan sa loob ng MTBD (gray).Ang Net Charge Per Residue (NCPR) na mapa ng Tau441 ay ipinapakita.f Gamit ang 1 µM AF488 na may label na αS at Atto647N na may label na ΔNt-, gamit ang 1 µM AF488 na may label na αS o ΔCt-αS sa pagkakaroon ng ΔNt-Tau (itaas, 10 µM bawat protina) o K18 (ibaba, 50 µM ) ) ) micrographs ng WF condensed sa LLPS o K18 buffer.Ang mga scale bar sa isang larawan ay kumakatawan sa sukat ng lahat ng mga larawan sa isang panel (20 µm para sa mga panel a, b at f).Ang raw data para sa mga panel c at d ay ibinibigay bilang raw data file.
Upang subukan ang papel ng αS sa prosesong ito ng LLPS, sinisiyasat muna namin ang epekto ng αS sa katatagan ng droplet sa pamamagitan ng nephelometry gamit ang pagtaas ng mga konsentrasyon ng NaCl (Fig. 2c).Kung mas mataas ang konsentrasyon ng asin sa mga sample na naglalaman ng αS, mas mataas ang mga halaga ng scattering ng liwanag (sa 350 nm), na nagpapahiwatig ng pag-stabilize ng papel ng αS sa sistemang ito ng LLPS.Ang isang katulad na epekto ay maaaring maobserbahan sa pamamagitan ng pagtaas ng konsentrasyon ng αS (at samakatuwid ay ang αS:Tau441 ratio) sa tantiya.10-tiklop na pagtaas kaugnay sa konsentrasyon ng tau (5 µM) (Larawan 2d).Upang ipakita na ang αS ay isang scaffold protein sa coacervates, napagpasyahan naming siyasatin ang pag-uugali ng LLPS-disrupted Tau mutant, na kulang sa isang negatibong sisingilin na rehiyon ng N-terminal (nalalabi 1–150, tingnan ang Fig. 2e) na tinatawag na ΔNt-Tau.Kinumpirma ng WF microscopy at nephelometry na ang ΔNt-Tau mismo ay hindi sumailalim sa LLPS (Fig. 2f at Pandagdag na Fig. 2d), tulad ng naunang iniulat 14. Gayunpaman, nang idinagdag ang αS sa mga dispersion solution ng truncated Tau variant na ito, ang proseso ng LLPS ay ganap na naibalik na may droplet density na malapit sa droplet density ng full-size na solusyon ng Tau at αS sa ilalim ng magkatulad na mga kondisyon at konsentrasyon ng protina.Ang prosesong ito ay maaari ding maobserbahan sa ilalim ng mga kondisyon ng mababang macromolecular crowding (Karagdagang Fig. 2c).Ang papel na ginagampanan ng rehiyon ng C-terminal αS, ngunit hindi ang buong haba nito, sa proseso ng LLPS ay ipinakita sa pamamagitan ng pagsugpo sa pagbuo ng droplet gamit ang isang C-terminal truncated αS na variant na kulang sa residues 104–140 (Fig. 1a) ng (ΔCt- αS) na protina (Larawan 2f at Karagdagang Larawan 2d).Ang colocalization ng αS at ΔNt-Tau ay nakumpirma ng confocal fluorescence microscopy (Karagdagang Fig. 1b).
Upang higit pang subukan ang mekanismo ng LLPS sa pagitan ng Tau441 at αS, ginamit ang isang karagdagang variant ng Tau, lalo na ang ipinares na helical filament core (PHF) na fragment sa microtubule-binding domain (MTBD), na kung naglalaman ito ng apat na katangian na umuulit na mga domain, na karaniwang kilala rin. bilang fragment ng K18 (tingnan ang Fig. 2e).Kamakailan ay naiulat na ang αS ay mas gusto na nagbubuklod sa isang tau protein na matatagpuan sa isang proline-rich domain sa isang pagkakasunud-sunod na nauuna sa microtubule-binding domain.Gayunpaman, ang rehiyon ng PHF ay mayaman din sa mga positibong sisingilin na nalalabi (tingnan ang Larawan 2e), lalo na ang lysine (15% na nalalabi), na nag-udyok sa amin na subukan kung ang rehiyon na ito ay nag-aambag din sa paghalay ng αS / Tau complex.Napansin namin na ang K18 lamang ay hindi maaaring mag-trigger ng LLPS sa mga konsentrasyon hanggang sa 100 μM sa ilalim ng mga kondisyon na nasubok (LLPS buffer na may 15% PEG o 20% dextran) (Larawan 2f).Gayunpaman, kapag nagdagdag kami ng 50 µM αS hanggang 50 µM K18, ang mabilis na pagbuo ng mga droplet ng protina na naglalaman ng K18 at αS ay naobserbahan ng nephelometry (Supplement Fig. 2d) at WF microscopy (Fig. 2f).Tulad ng inaasahan, hindi naibalik ng ΔCt-αS ang pag-uugali ng LLPS ng K18 (Larawan 2f).Napansin namin na ang pagsasama-sama ng αS/K18 ay nangangailangan ng bahagyang mas mataas na mga konsentrasyon ng protina upang mahikayat ang LLPS kumpara sa αS/ΔNt-Tau o αS/Tau441, ang iba pang mga bagay ay pantay.Ito ay naaayon sa isang mas malakas na pakikipag-ugnayan ng αS C-terminal na rehiyon na may proline-rich Tau domain kumpara sa microtubule-binding domain, tulad ng inilarawan dati 31 .
Ibinigay na ang ΔNt-Tau ay hindi maaaring magsagawa ng LLPS sa kawalan ng αS, pinili namin ang variant ng Tau na ito bilang isang modelo para sa pagkilala sa αS/Tau LLPS dahil sa pagiging simple nito sa mga sistema ng LLPS na may buong haba na Tau (isotype, Tau441/Tau441).na may kumplikadong (heterotypic, αS/Tau441) na proseso ng pagsasama-sama.Inihambing namin ang antas ng pagsasama-sama ng αS (bilang bahagi ng condensed phase protein, fαS, c) sa mga sistema ng αS / Tau at αS / ΔNt-Tau sa pamamagitan ng centrifugation at dispersed phase na pagsusuri ng SDS-PAGE (tingnan ang 2e), natagpuan ang magkatulad na mga halaga para sa lahat ng mga protina sa parehong konsentrasyon.Sa partikular, nakuha namin ang fαS, c 84 ± 2% at 79 ± 7% para sa αS / Tau at αS / ΔNt-Tau, ayon sa pagkakabanggit, na nagmumungkahi na ang heterotypic na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng αS at tau ay higit na mataas sa pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga molekula ng tau.sa pagitan.
Ang pakikipag-ugnayan sa iba't ibang polycations at ang epekto ng proseso ng condensation sa αS kinetics ay unang pinag-aralan ng fluorescence recovery pagkatapos ng photobleaching (FRAP) na pamamaraan.Sinubukan namin ang αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau at αS/pLK coacervates (100 μM αS na pupunan ng 2 μM αS AF488-αS at 100 μM Tau441 o ΔNt-Tau o 1 mM pLK).Ang data ay nakuha sa loob ng unang 30 minuto pagkatapos ng paghahalo ng mga sample na bahagi.Mula sa kinatawan ng mga larawan ng FRAP (Fig. 3a, αS/Tau441 condensation) at ang kanilang kaukulang time course curves (Fig. 3b, Supplementary Fig. 3), makikita na ang αS kinetics ay halos kapareho sa Tau441 coacervates.at ΔNt-Tau, na mas mabilis sa pLK.Ang kinakalkula na mga diffusion coefficient para sa αS sa loob ng coacervate ayon sa FRAP (tulad ng inilarawan ni Kang et al. 35) ay D = 0.013 ± 0.009 µm2/s at D = 0.026 ± 0.008 µm2/s para sa αS/TauS/s para sa αS/TauS/s para sa αS/TauS/s. ang αS/ system.pLK, Tau, at D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, ayon sa pagkakabanggit (Larawan 3c).Gayunpaman, ang diffusion coefficient αS sa dispersed phase ay ilang mga order ng magnitude na mas mataas kaysa sa lahat ng condensed phase, tulad ng tinutukoy ng Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS, tingnan ang Pandagdag na Fig. 3) sa ilalim ng parehong mga kondisyon (LLPS buffer) ngunit sa kawalan ng polycations ( D = 8 ± 4 µm2/s).Samakatuwid, ang mga kinetics ng pagsasalin ng αS ay makabuluhang nabawasan sa mga coacervates kumpara sa mga protina sa dispersed phase dahil sa binibigkas na mga epekto ng molecular crowding, kahit na ang lahat ng coacervates ay nagpapanatili ng mga katangiang tulad ng likido sa unang kalahating oras pagkatapos ng kanilang pagbuo, sa kaibahan sa tau phase.mas mabilis na kinetics sa pLK condensate.
a–c FRAP analysis ng αS dynamics (2% AF488-labeled αS) sa mga electrostatic coacervates.Ang mga kinatawan na larawan ng αS/Tau441 FRAP assays sa triplicate ay ipinapakita sa (a), kung saan ang mga pulang bilog ay nagpapahiwatig ng mga decolorized na lugar.Ang scale bar ay 5 µm.b Average na mga curve ng FRAP at (c) nakalkula ang mga diffusion coefficient (D) para sa 5–6 (N) iba't ibang droplet mula sa tatlong eksperimento gamit ang 100 µM αS at equimolar na konsentrasyon ng Tau441 (pula) o ΔNt-Tau (asul) o pLK (berde) sa sampung beses ang konsentrasyon ng LLPS.Ang karaniwang paglihis ng curve ng FRAP ay ipinapakita sa may kulay na kulay.Para sa paghahambing, ang diffusion coefficient αS sa dispersed phase ay tinutukoy sa triplicate gamit ang fluorescence correlation spectroscopy (FCS) (tingnan ang Karagdagang Larawan 3 at mga pamamaraan para sa karagdagang impormasyon).d Patuloy na X-band EPR spectra ng 100 μM TEMPOL-122-αS sa LLPS buffer nang walang anumang polycation (itim) o sa pagkakaroon ng 100 μM Tau441 (pula) o ΔNt-Tau (asul) o 1 mM pLK (berde).Ang inset ay nagpapakita ng pinalaki na view ng malalakas na linya ng field kung saan nagaganap ang pinakamaraming pagbabago.e Binding curves ng 50 μM TEMPOL-122-αS na may iba't ibang polycation sa kawalan ng LLPS (walang PEG).Ang pinababang amplitude ng banda III kumpara sa banda II (IIII/III) ng normalized na spectrum ng EPR ay ipinapakita upang mapataas ang molar ratios ng Tau441 (pula), ΔNt-Tau (asul) at pLK (berde).Ang mga may kulay na linya ay nagpapakita ng akma sa data gamit ang isang rough binding model na may n magkapareho at independiyenteng binding site sa bawat curve.Ang raw data ay ibinibigay sa anyo ng mga raw data file.
Bilang pandagdag, sinisiyasat namin ang dynamics ng αS sa iba't ibang coacervates gamit ang directed spin labeling (SDSL) at tuloy-tuloy na electron paramagnetic resonance (CW-EPR).Ang pamamaraang ito ay napatunayang lubhang kapaki-pakinabang sa pag-uulat ng flexibility at dynamics ng IDP na may makatotohanang natitirang resolusyon36,37,38.Sa layuning ito, nagtayo kami ng mga nalalabi sa cysteine ​​​​sa iisang Cys mutants at ginamit ang 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) spin probe.Ang mga derivatives ng maleimide ay may label sa kanila.Mas partikular, naglagay kami ng mga TEMPOL probe sa posisyong 122 o 24 αS (TEMPOL-122-αS at TEMPOL-24-αS).Sa unang kaso, tina-target namin ang C-terminal na rehiyon ng protina, na kasangkot sa pakikipag-ugnayan sa mga polycation.Sa halip, ang posisyon 24 ay maaaring magbigay sa amin ng impormasyon tungkol sa pangkalahatang dinamika ng mga protina sa condensate.Sa parehong mga kaso, ang mga signal ng EPR na nakuha para sa mga protina ng dispersed phase ay tumutugma sa nitroxide radical sa mabilis na paglipat ng estado.Pagkatapos ng phase separation sa pagkakaroon ng tau o pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 o ΔNt-Tau sa ratio na 1:1 o pLK sa ratio na 1:10), isang pagtaas sa relatibong peak intensity ay na-obserbahan sa ang EPR spectrum ng αS.Lumawak ang linya ng pagkawala, na nagpapahiwatig ng nabawasan na αS reorientation kinetics sa mga droplet kumpara sa protina sa dilute phase (Fig. 3d, Pandagdag na Fig. 4a).Ang mga pagbabagong ito ay mas malinaw sa posisyon 122. Habang sa posisyon 24 ang presensya ng pLK ay hindi nakakaapekto sa kinetics ng probe, sa posisyon 122 ang parang multo na hugis ng linya ay nagbago nang malaki (Karagdagang Fig. 4a).Nang sinubukan naming i-modelo ang spectra sa posisyon 122 ng dalawang αS/polycation system gamit ang isotropic model (Karagdagang Larawan 5a) na karaniwang ginagamit upang ilarawan ang dynamics ng spin-label na IDP38,39, hindi namin nagawang buuin muli ang eksperimentong spectra..Spectral simulation ng posisyon ng 24 spins contrasts (Karagdagang Fig. 5a).Iminumungkahi nito na mayroong mga kagustuhang posisyon sa espasyo ng mga pagsasaayos ng spin ng C-terminal na rehiyon ng αS sa pagkakaroon ng mga polycation.Kapag isinasaalang-alang ang bahagi ng αS sa condensed phase sa ilalim ng mga eksperimentong kondisyon ng EPR (84 ± 2%, 79 ± 7%, at 47 ± 4% para sa αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, at αS/pLK, ayon sa pagkakabanggit—tingnan ang Karagdagang Fig. 2e ng data analysis c), makikita na ang pagpapalawak na nakita ng EPR method ay pangunahing sumasalamin sa pakikipag-ugnayan ng C-terminal region ng αS na may iba't ibang polycations sa condensed phase (ang pangunahing pagbabago kapag gumagamit ng TEMPOL-122- αS), at hindi condensation ng protina.Ang isang pagtaas sa microviscosity ay sinusunod sa probe.Tulad ng inaasahan, ang EPR spectrum ng protina sa ilalim ng mga kondisyon maliban sa LLPS ay ganap na naibalik kapag ang 1 M NaCl ay idinagdag sa pinaghalong (Karagdagang Fig. 4b).Sa pangkalahatan, iminumungkahi ng aming data na ang mga pagbabagong nakita ng CW-EPR ay pangunahing sumasalamin sa pakikipag-ugnayan ng C-terminal na rehiyon ng αS na may iba't ibang mga polycation sa condensed phase, at ang pakikipag-ugnay na ito ay lumilitaw na mas malakas sa pLK kaysa sa Tau.
Upang makakuha ng higit pang impormasyon sa istruktura tungkol sa mga protina sa coacervate, nagpasya kaming pag-aralan ang sistema ng LLPS gamit ang NMR sa solusyon.Gayunpaman, maaari lamang nating makita ang bahagi ng αS na natitira sa dispersed phase, na maaaring dahil sa nabawasan na dinamika ng protina sa loob ng coacervate at isang siksik na yugto sa ilalim ng solusyon sa pagsusuri ng NMR.Kapag sinuri namin ang istraktura at dinamika ng protina na natitira sa dispersed phase ng sample ng LLPS gamit ang NMR (Karagdagang Fig. 5c, d), napansin namin na halos magkapareho ang pagkilos ng protina sa pagkakaroon ng pLK at ΔNt-Tau, pareho ng na nasa pangalawang istraktura at dinamika ng backbone ng protina, na ipinahayag ng mga eksperimento sa pangalawang chemical shift at R1ρ relaxation.Ipinapakita ng data ng NMR na ang C-terminus ng αS ay dumaranas ng malaking pagkawala ng conformational flexibility habang pinapanatili ang hindi maayos na kalikasan nito, tulad ng iba pang pagkakasunud-sunod ng protina, dahil sa mga pakikipag-ugnayan nito sa mga polycation.
Dahil ang pagpapalawak ng signal ng CW-EPR na sinusunod sa TEMPOL-122-αS condensed phase ay sumasalamin sa pakikipag-ugnayan ng protina sa polycations, nagsagawa kami ng EPR titration upang suriin ang nagbubuklod na pagkakaugnay ng αS sa iba't ibang polycation sa kawalan ng LLPS (walang akumulasyon ng Buffer LLPS), na nagmumungkahi na ang mga pakikipag-ugnayan ay pareho sa dilute at concentrated phase (na kinumpirma ng aming data, Pandagdag na Fig. 4a at Pandagdag na Fig. 6).Ang layunin ay upang makita kung ang lahat ng mga coacervate, sa kabila ng kanilang karaniwang mga katangian na tulad ng likido, ay nagpapakita ng anumang pinagbabatayan na kaugalian ng kaugalian sa antas ng molekular.Tulad ng inaasahan, lumawak ang spectrum ng EPR sa pagtaas ng konsentrasyon ng polycation, na sumasalamin sa pagbawas sa molecular flexibility dahil sa mga molekular na pakikipag-ugnayan ng lahat ng mga kasosyo sa pakikipag-ugnayan halos sa saturation (Larawan 3e, Pandagdag na Larawan 6).Nakamit ng pLK ang saturation na ito sa isang mas mababang molar ratio (polycation:αS) kumpara sa ΔNt-Tau at Tau441.Sa katunayan, ang paghahambing ng data sa isang tinatayang modelong nagbubuklod na ipinapalagay n magkapareho at independiyenteng mga site na nagbubuklod ay nagpakita na ang maliwanag na dissociation constant ng pLK (~ 5 μM) ay isang order ng magnitude na mas mababa kaysa sa Tau441 o ΔNt-Tau (~ 50 μM ).µM).Bagaman ito ay isang magaspang na pagtatantya, iminumungkahi nito na ang αS ay may mas mataas na pagkakaugnay para sa mas simpleng mga polycation na may patuloy na positibong mga rehiyon ng singil.Dahil sa pagkakaibang ito sa pagkakaugnay sa pagitan ng αS at iba't ibang polycations, na-hypothesize namin na ang kanilang mga likidong katangian ay maaaring magbago nang iba sa paglipas ng panahon at sa gayon ay nagdurusa mula sa iba't ibang mga proseso ng LSPT.
Dahil sa napakasikip na kapaligiran sa loob ng protein coacervate at ang amyloid na kalikasan ng protina, napagmasdan namin ang pag-uugali ng coacervate sa paglipas ng panahon upang makita ang mga posibleng proseso ng LSPT.Gamit ang BF at CF microscopy (Larawan 4), napansin namin na ang αS/Tau441 ay nag-coacervate sa isang malaking lawak sa solusyon, na bumubuo ng malalaking droplet na nakikipag-ugnay at nagbabasa sa ibabaw sa ilalim ng balon/slide bilang mga buong droplet, tulad ng inaasahan (Karagdagang Fig 7d);tinatawag nating "mga balsa ng protina" ang mga istrukturang ito na nabuo sa ilalim.Ang mga istrukturang ito ay nanatiling tuluy-tuloy habang pinapanatili nila ang kakayahang mag-fuse (Karagdagang Fig. 7b) at makikita ng ilang oras pagkatapos ma-trigger ang LLPS (Larawan 4 at Karagdagang Larawan 7c).Napagmasdan namin na ang proseso ng basa ay pinapaboran sa ibabaw ng hydrophilic kaysa sa mga hydrophobic na materyales (Karagdagang Fig. 7a), tulad ng inaasahan para sa mga electrostatic coacervates na may hindi balanseng mga singil at sa gayon ay mataas na electrostatic na mga potensyal sa ibabaw.Kapansin-pansin, ang αS/ΔNt-Tau coalescence at rafting ay makabuluhang nabawasan, habang ang αS/pLK condensates ay makabuluhang nabawasan (Fig. 4).Sa maikling panahon ng pagpapapisa ng itlog, ang mga droplet ng αS/pLK ay nakapag-coalesce at nabasa ang hydrophilic surface, ngunit ang prosesong ito ay mabilis na huminto at pagkatapos ng 5 oras ng incubation, limitado lamang ang mga coalescence na kaganapan at walang basa ang naobserbahan.– paglipat ng gel-drip.
Kinatawan ng BF (greyscale panel) at CF (kanang mga panel, AF488 na may label na αS sa berde) ng mga coacervate sample na naglalaman ng 100 µM αS (1% fluorescent label) sa LLPS buffer sa pagkakaroon ng 100 µM Tau441 (nangungunang) fluorescence na mga larawang microscopic -Tau (gitna) o 1 mM pLK (ibaba) sa iba't ibang oras ng incubation at focal height (z, distansya mula sa ilalim ng balon ng plato).Ang mga eksperimento ay inulit ng 4-6 na beses nang nakapag-iisa sa bawat isa na may parehong mga resulta.Ang αS/Tau441 coacervates ay binabasa pagkatapos ng 24 na oras, na bumubuo ng mga balsa na mas malaki kaysa sa imahe.Ang scale bar para sa lahat ng larawan ay 20 µm.
Pagkatapos ay tinanong namin kung ang malalaking likido na tulad ng mga pool ng protina na nabuo sa αS / Tau441 LLPS ay hahantong sa pagsasama-sama ng amyloid ng alinman sa mga protina na pinag-aralan.Sinundan namin ang pagkahinog ng αS/Tau441 droplets sa paglipas ng panahon gamit ang WF microscopy sa ilalim ng parehong mga kondisyon tulad ng nasa itaas, ngunit gamit ang 1 μM AF488 na may label na αS at Atto647N na may label na Tau441 (Fig. 5a).Tulad ng inaasahan, napansin namin ang kumpletong lokalisasyon ng protina sa buong proseso ng pagkahinog.Kapansin-pansin, mula sa ca.Pagkatapos ng 5 oras, mas matindi ang mga non-circular na istruktura ang naobserbahan sa loob ng mga balsa, na tinatawag naming "puntos", ang ilan ay na-colocalize sa αS, at ang ilan ay pinayaman sa Tau441 (Larawan 5a, puting mga arrow).Ang mga spot na ito ay palaging naobserbahan sa loob ng mga balsa sa mas malaking lawak para sa αS/ΔNt-Tau kaysa sa αS/ΔNt-Tau.Walang mga natatanging spot sa mga droplet ng pLK at Tau system na walang kakayahan para sa pagsasanib/pagbasa.Upang masubukan kung ang mga mantsa na naglalaman ng αS at Tau441 ay mga pinagsama-samang tulad ng amyloid, nagsagawa kami ng isang katulad na eksperimento gamit ang CF microscopy kung saan ang Tau441 ay may label na Atto647N at 12.5 μM amyloid-specific na thioflavin-T (ThT) ay idinagdag mula sa simula.pangkulay.Kahit na ang ThT-staining ng αS/Tau441 droplets o rafts ay hindi naobserbahan kahit na pagkatapos ng 24 h ng incubation (Fig. 5b, top row—natitirang droplets sa ibabaw ng protein rafts), ang ThT-positive structures na naglalaman ng Atto647N-Tau441 sa loob ng rafts ay napakahina.ginagaya nito ang laki, hugis, at lokasyon ng mga naunang inilarawan na mga spot (Larawan 5b, gitna at ibabang mga hilera), na nagmumungkahi na ang mga batik ay maaaring tumutugma sa mga aggregate na tulad ng amyloid na nabuo sa mga tumatandang fluid coacervate.
WF 25 μM αS sa iba't ibang oras ng incubation at focal heights (z, distansya mula sa unbound na ibaba) sa pagkakaroon ng 25 μM Tau441 (1 μM AF488 na may label na αS at Atto647N na may label na Tau441) sa isang balon ng microscope plate na may LLPS buffer) .Anim na eksperimento ang independiyenteng inulit na may katulad na mga resulta.b CF microscopic na imahe ng 25 μM αS sa pagkakaroon ng 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-label na Tau441) at 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Ang mga matimbang na patak ng protina at nakadeposito na mga raft ng protina at mga spot ay ipinapakita sa itaas at gitnang mga hilera, ayon sa pagkakabanggit.Ang ibabang hilera ay nagpapakita ng mga larawan ng mga balsa at mga patak mula sa 3 independiyenteng mga replika.Ang mga puting arrow ay nagpapahiwatig ng mga tuldok na positibo sa ThT sa parehong mga panel.Ang scale bar para sa lahat ng larawan ay 20 µm.
Upang suriin nang mas detalyado ang mga pagbabago sa network ng coacervate na protina sa panahon ng paglipat mula sa likido hanggang solid, ginamit namin ang fluorescence lifetime imaging (FLIM) at Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (Larawan 6 at Mga Karagdagang Larawan 8 at 9).Ipinagpalagay namin na ang coacervate maturation ng layer sa isang mas condensed o kahit na solid-like na pinagsama-samang istraktura ng protina ay humahantong sa mas malapit na pakikipag-ugnay sa pagitan ng protina at ang fluorescent probe na nakakabit dito, na potensyal na makagawa ng isang quenching effect na ipinakita sa isang pinaikling probe lifetime (τ) , gaya ng inilarawan dati40.,41 ,42.Bilang karagdagan, para sa mga double label na sample (AF488 at Atto647N bilang FRET donor at acceptor dyes, ayon sa pagkakabanggit), ang pagbaba sa τ ay maaari ding samahan ng coacervate condensation at pagtaas ng kahusayan ng FRET(E) sa panahon ng LSPT.Sinusubaybayan namin ang pagbuo ng raft at spot sa paglipas ng panahon sa mga sample ng LLPS αS/Tau441 at αS/ΔNt-Tau (25 µM ng bawat protina sa LLPS buffer na naglalaman ng 1 µM AF488 na may label na αS at/o Atto647N na may label na Tau441 o ΔNt-Tau).Napansin namin ang isang pangkalahatang trend na ang fluorescence lifetime ng AF488 (τ488) at Atto647N (τ647N) probes ay bahagyang nabawasan habang ang mga coacervates ay nag-mature (Larawan 6 at Karagdagang Fig. 8c).Kapansin-pansin, ang pagbabagong ito ay makabuluhang pinahusay para sa mga tuldok sa loob ng mga balsa (Larawan 6c), na nagpapahiwatig na ang karagdagang paghalay ng protina ay naganap sa mga tuldok.Bilang suporta dito, walang makabuluhang pagbabago sa fluorescence lifetime ang naobserbahan para sa αS/ΔNt-Tau droplets na may edad na 24 h (Karagdagang Fig. 8d), na nagmumungkahi na ang droplet gelation ay isang proseso na naiiba sa spotting at hindi sinamahan ng makabuluhang molekular na reorganisasyon. sa loob ng coacervates.Dapat pansinin na ang mga tuldok ay may iba't ibang laki at variable na nilalaman sa αS, lalo na para sa αS/Tau441 system (Karagdagang Fig. 8e).Ang pagbaba ng buhay ng spot fluorescence ay sinamahan ng pagtaas ng intensity, lalo na para sa Atto647N na may label na Tau441 (Karagdagang Fig. 8a), at mas mataas na kahusayan ng FRET para sa parehong αS/Tau441 at αS/ΔNt-Tau system, na nagpapahiwatig ng karagdagang condensation sa LLPS Limang oras pagkatapos mag-trigger, ang mga protina sa loob ng static na kuryente ay nag-condensed.Kung ikukumpara sa αS/ΔNt-Tau, napansin namin ang mas mababang τ647N at medyo mas mataas na τ488 na halaga sa mga αS/Tau441 spot, na sinamahan ng mas mababa at mas hindi magkakatulad na mga halaga ng FRET.Posible, ito ay maaaring nauugnay sa katotohanan na sa sistema ng αS/Tau441, ang naobserbahan at inaasahang kasaganaan ng αS sa mga pinagsama-samang ay mas heterogenous, madalas substoichiometric kumpara sa Tau, dahil ang Tau441 mismo ay maaari ring sumailalim sa LLPS at pagsasama-sama (Karagdagang Fig. 8e) .Gayunpaman, ang antas ng droplet coalescence, pagbuo ng raft, at, mahalaga, ang pagsasama-sama ng protina sa loob ng mga likidong tulad ng coacervates ay pinakamataas kapag pareho ang Tau441 at αS.
isang Lifetime fluorescence microscopy (FLIM) na mga larawan ng αS/Tau441 at αS/ΔNt-Tau sa 25 μM ng bawat protina (1 μM AF488 na may label na αS at 1 μM Atto647N na may label na Tau441 o ΔNt-Tau) sa LLPS buffer.Ang mga haligi ay nagpapakita ng mga kinatawan na larawan ng mga sample ng LLPS sa iba't ibang oras ng pagkahinog (30 min, 5 h at 24 h).Ipinapakita ng pulang frame ang rehiyon na naglalaman ng mga αS/Tau441 spot.Ang mga haba ng buhay ay ipinapakita bilang mga bar ng kulay.Scale bar = 20 µm para sa lahat ng larawan.b Naka-zoom-in na FLIM na imahe ng napiling lugar, na ipinapakita sa pulang kahon sa panel a.Ang mga saklaw ng buhay ay ipinapakita gamit ang parehong sukat ng kulay tulad ng sa panel a.Scale bar = 5 µm.c Histograms na nagpapakita ng AF488 (naka-attach sa αS) o Atto647N (naka-attach sa Tau) para sa iba't ibang species ng protina (droplets-D-, raft-R- at speckle-P) na natukoy sa mga larawan ng FLIM na naitala para sa αS-) timing distribution habang-buhay ng Tau441 at αS/ΔNt-Tau coacervate sample (N = 17-32 ROI para sa D, 29-44 ROI para sa R, at 21-51 ROI para sa mga puntos).Ang mga mean at median na halaga ay ipinapakita bilang mga dilaw na parisukat at itim na linya sa loob ng mga kahon, ayon sa pagkakabanggit.Ang lower at upper bounds ng box ay kumakatawan sa una at ikatlong quartile, ayon sa pagkakabanggit, at ang minimum at maximum values ​​sa loob ng 1.5-fold interquartile range (IQR) ay ipinapakita bilang whiskers.Ang mga outlier ay ipinapakita bilang mga itim na diamante.Ang kabuluhan ng istatistika sa pagitan ng mga pares ng mga distribusyon ay natukoy gamit ang isang dalawang-sample na t-test, sa pag-aakalang hindi pantay na mga pagkakaiba-iba.Ang two-tailed t-test p-value ay ipinapakita na may mga asterisk para sa bawat pares ng inihambing na data (* p-value > 0.01, ** p-value > 0.001, *** p-value > 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns ay nagpapahiwatig ng kapabayaan (p-value > 0.05).Ang eksaktong p value ay ibinibigay sa Karagdagang Talahanayan 1, at ang orihinal na data ay ipinakita bilang mga raw data file.
Upang higit pang maipakita ang mala-amiloid na katangian ng mga speckle/aggregate, ginagamot namin ang mga hindi nabahiran na mga sample ng coacervate sa loob ng 24 na oras na may mataas na konsentrasyon ng (1 M) NaCl, na nagresulta sa paghihiwalay ng mga pinagsama-samang mga coacervate ng protina.Kapag ang mga nakahiwalay na aggregate (ibig sabihin, isang dispersed solution ng aggregates) ay naobserbahan gamit ang atomic force microscopy (AFM), naobserbahan namin ang isang nakararami na spherical morphology na may regular na taas na humigit-kumulang 15 nm, na may posibilidad na mag-ugnay sa ilalim ng mga kondisyon ng mataas na konsentrasyon ng asin, katulad ng ang pag-uugali ng mga tipikal na amyloid fibrils dahil sa malakas na epekto ng hydrophobic sa ibabaw (tandaan na ang mga fibril ay karaniwang may taas na ~10 nm) (Karagdagang Fig. 10a).Kapansin-pansin, kapag ang mga nakahiwalay na aggregate ay natupok ng ThT sa isang karaniwang ThT fluorescence assay, napansin namin ang isang dramatikong pagtaas sa ThT fluorescence quantum yield, na maihahambing sa naobserbahan noong ang dye ay incubated na may tipikal na αS amyloid fibrils (Karagdagang Fig. 10b), na nagmumungkahi na ang mga coacervate aggregates ay naglalaman ng mga istrukturang tulad ng amyloid..Sa katunayan, ang mga aggregate ay mapagparaya sa mataas na konsentrasyon ng asin ngunit sensitibo sa 4 M guanidine chloride (GdnHCl), tulad ng mga tipikal na amyloid fibrils (Karagdagang Fig. 10c).
Susunod, sinuri namin ang komposisyon ng mga pinagsama-samang gamit ang solong molecule fluorescence, tiyak na fluorescence correlation/cross-correlation spectroscopy (FCS/FCCS), at burst analysis ng two-color coincidence detection (TCCD).Sa layuning ito, naghiwalay kami ng mga pinagsama-samang nabuo pagkatapos ng 24 na oras ng pagpapapisa ng itlog sa 100 μl na mga sample ng LLPS na naglalaman ng αS at Tau441 (parehong 25 μM) kasama ang 1 μM AF488 na may label na αS at 1 μM Atto647N na may label na Tau441.Dilute ang nagreresultang dispersed aggregate solution sa isang monomolecular state gamit ang parehong PEG-free buffer at 1 M NaCl (ang parehong buffer na ginamit upang paghiwalayin ang mga aggregate mula sa coacervate) upang maiwasan ang anumang posibleng electrostatic na interaksyon sa pagitan ng LLPS at protina.Ang isang halimbawa ng time trajectory ng isang molekula ay makikita sa Fig. 7a.Ang pagsusuri ng FCCS/FCS (cross-correlation, CC at autocorrelation, AC) ay nagpakita na ang mga pinagsama-samang naglalaman ng αS at tau ay sagana sa mga sample (tingnan ang CC curve sa Fig. 7b, kaliwang panel), at ang labis na natitirang monomeric na protina ay lumitaw bilang isang resulta ng proseso ng pagbabanto (tingnan ang AC curves sa Figure 7b, kaliwang panel).Ang mga eksperimento sa kontrol na isinagawa sa ilalim ng parehong mga kondisyon ng solusyon gamit ang mga sample na naglalaman lamang ng mga monomeric na protina ay hindi nagpakita ng mga curve ng CC, at ang mga AC curve ay angkop na angkop sa isang-bahaging modelo ng pagsasabog (Eq. 4), kung saan ang mga monomeric na protina ay may inaasahang mga diffusion coefficient (Larawan 7b). ), kanang panel).Ang diffusion coefficient ng pinagsama-samang mga particle ay mas mababa sa 1 µm2/s, at ang monomeric na protina ay humigit-kumulang 1 µm2/s.50–100 µm/s;ang mga halaga ay katulad ng naunang nai-publish na mga halaga para sa sonicated αS amyloid fibrils at monomeric αS nang hiwalay sa ilalim ng magkatulad na kondisyon ng solusyon44.Kapag sinuri namin ang mga pinagsama-samang may pagsusuri sa pagsabog ng TCCD (Larawan 7c, tuktok na panel), nalaman namin na sa bawat nakahiwalay na pinagsama-samang (αS/Tau heteroaggregate), humigit-kumulang 60% ng mga natukoy na pinagsama-samang naglalaman ng parehong αS at tau, mga 30% lamang ang nilalaman. tau, mga 10% αS lang.Ang stoichiometric analysis ng αS / Tau heteroaggregates ay nagpakita na ang karamihan sa mga heteroaggregate ay pinayaman sa tau (stoichiometry sa ibaba 0.5, ang average na bilang ng tau molecule bawat pinagsama-samang ay 4 na beses na higit pa kaysa sa αS molecules), na naaayon sa aming trabaho na naobserbahan sa FLIM in situ. mga eksperimento..Ipinakita ng pagsusuri ng FRET na ang mga pinagsama-samang ito ay naglalaman ng parehong mga protina, kahit na ang aktwal na mga halaga ng FRET sa kasong ito ay hindi napakahalaga, dahil ang pamamahagi ng mga fluorophores sa bawat pinagsama-sama ay random dahil sa labis na hindi na-label na protina na ginamit sa eksperimento.Kapansin-pansin, kapag nagsagawa kami ng parehong pagsusuri gamit ang 45,46 mature na amyloid aggregation-deficient Tau variant (tingnan ang Pandagdag na Fig. 11a, b), napansin namin na kahit na ang αS electrostatic aggregation ay pareho (Karagdagang Fig. 11c, d), ang kakayahang bumuo ng mga aggregate sa loob ng coacervate ay lubhang nabawasan at ang FLIM ay naka-detect ng ilang mga spot sa in situ na mga eksperimento, at ang mahinang cross-correlation curves ay naobserbahan para sa mga nakahiwalay na aggregate sample.Gayunpaman, para sa isang maliit na bilang ng mga nakitang pinagsama-samang (isang ikasampu lamang ng Tau441), napagmasdan namin na ang bawat pinagsama-samang ay pinayaman sa αS kaysa sa variant na ito ng Tau, na may humigit-kumulang 50% ng mga nakitang pinagsama-samang naglalaman lamang ng mga molekula ng αS, at ang αS ay labis na heterogenous. .aggregates (tingnan ang Pandagdag na Fig. 11e), sa kaibahan sa mga heterogenous na aggregates na nabuo ng Tau441 (Fig. 6f).Ang mga resulta ng mga eksperimentong ito ay nagpakita na kahit na ang αS mismo ay may kakayahang mag-ipon ng tau sa loob ng coacervate, ang tau nucleation ay mas kanais-nais sa ilalim ng mga kundisyong ito, at ang mga nagresultang amyloid-like aggregates ay maaaring kumilos bilang isang anyo ng αS at tau.Gayunpaman, sa sandaling mabuo ang isang core na mayaman sa tau, ang mga heterotypic na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng αS at tau ay pinapaboran sa mga pinagsama-sama kaysa sa mga homotypic na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga molekula ng tau;inoobserbahan din namin ang mga network ng protina sa likidong αS/tau coacervates.
isang Kinatawan ng fluorescence temporal na bakas ng mga solong molekula ng mga nakahiwalay na pinagsama-samang nabuo sa αS/Tau441 electrostatic coacervates.Ang mga pagsabog na nauugnay sa αS/Tau441 coaggregates (mga pagsabog sa itaas ng ipinahiwatig na threshold) ay na-obserbahan sa tatlong mga channel ng pagtuklas (AF488 at Atto647N na paglabas pagkatapos ng direktang paggulo, asul at pulang linya, Atto647N na paglabas pagkatapos ng hindi direktang paggulo), FRET, violet na linya).b Pagsusuri ng FCS/FCCS ng isang sample ng mga nakahiwalay na αS/Tau441 na pinagsama-samang nakuha mula sa LLPS (kaliwang panel).Ang mga autocorrelation (AC) na curve para sa AF488 at Atto647N ay ipinapakita sa asul at pula, ayon sa pagkakabanggit, at ang mga cross-correlation (CC) na curve na nauugnay sa mga pinagsama-samang naglalaman ng parehong mga tina ay ipinapakita sa purple.Ang mga AC curve ay sumasalamin sa pagkakaroon ng may label na monomeric at pinagsama-samang mga species ng protina, habang ang CC curves ay nagpapakita lamang ng pagsasabog ng mga double-label na pinagsama-samang.Ang parehong pagsusuri, ngunit sa ilalim ng parehong mga kondisyon ng solusyon tulad ng sa mga nakahiwalay na lugar, ang mga sample na naglalaman lamang ng monomeric αS at Tau441 ay ipinapakita bilang mga kontrol sa kanang panel.c Fluorescence flash analysis ng mga solong molekula ng mga nakahiwalay na aggregate na nabuo sa αS/Tau441 electrostatic coacervates.Ang impormasyon para sa bawat pinagsama-samang natagpuan sa apat na magkakaibang pag-uulit (N = 152) ay naka-plot laban sa kanilang stoichiometry, mga halaga ng S, at kahusayan ng FRET (nangungunang panel, ang color bar ay sumasalamin sa paglitaw).Tatlong uri ng aggregate ang maaaring makilala: -αS-only aggregates na may S~1 at FRET~0, Tau-only aggregates na may S~0 at FRET~1, at heterogenous Tau/αS aggregates na may intermediate S at FRET Estimates ng halaga ng parehong mga marker na protina na nakita sa bawat heterogenous na pinagsama-samang (N = 100) ay ipinapakita sa ibabang panel (ang sukat ng kulay ay sumasalamin sa paglitaw).Ang raw data ay ibinibigay sa anyo ng mga raw data file.
Ang pagkahinog o pagtanda ng likidong protina na condensates sa gel-like o solid na mga istruktura sa paglipas ng panahon ay naiulat na kasangkot sa ilang physiological function ng condensate47 pati na rin sa sakit, bilang isang abnormal na proseso bago ang amyloid aggregation 7, 48, 49. Dito pinag-aaralan namin ang phase separation at pag-uugali nang detalyado.Ang LSPT αS sa pagkakaroon ng mga random na polycation sa isang kinokontrol na kapaligiran sa mababang konsentrasyon ng micromolar at mga kondisyon na nauugnay sa physiologically (tandaan na ang kinakalkula na physiological na konsentrasyon ng αS ay> 1 µM50), kasunod ng tipikal na thermodynamically driven na pag-uugali ng LPS.Natagpuan namin na ang αS, na naglalaman ng isang mataas na negatibong sisingilin na rehiyon ng C-terminal sa physiological pH, ay nakakabuo ng mga droplet na mayaman sa protina sa may tubig na solusyon sa pamamagitan ng LLPS sa pagkakaroon ng mataas na cationic disordered peptides tulad ng pLK o Tau sa pamamagitan ng proseso ng electrostatic. kumplikadong paghalay sa pagkakaroon ng aggregation macromolecules.Ang prosesong ito ay maaaring magkaroon ng mga nauugnay na epekto sa cellular na kapaligiran kung saan nakatagpo ang αS ng iba't ibang polycationic molecule na nauugnay sa pagsasama-sama na nauugnay sa sakit kapwa sa vitro at sa vivo51,52,53,54.
Sa maraming mga pag-aaral, ang mga dinamika ng protina sa loob ng mga droplet ay itinuturing na isa sa mga pangunahing kadahilanan na tumutukoy sa proseso ng pagkahinog55,56.Sa electrostatic αS coacervates sa polycations, ang proseso ng maturation ay tila nakasalalay sa lakas ng mga pakikipag-ugnayan sa polycations, ang valence, at ang multiplicity ng mga pakikipag-ugnayan na ito.Ang teorya ng equilibrium ay nagmumungkahi na ang isang equilibrium na tanawin ng dalawang likidong estado ay ang pagkakaroon ng isang malaking patak na mayaman sa mga biopolymer na nagtutulak sa LLPS57,58.Ang paglaki ng droplet ay maaaring makamit sa pamamagitan ng Ostwald maturation59, coalescence60 o pagkonsumo ng libreng monomer sa dispersed phase61.Para sa αS at Tau441, ΔNt-Tau o pLK, karamihan sa protina ay puro sa condensate sa ilalim ng mga kondisyong ginamit sa pag-aaral na ito.Gayunpaman, habang ang mga full-size na droplet ng tau ay mabilis na nagsasama-sama sa ibabaw ng basa, ang droplet coalescence at basa ay mahirap para sa ΔNt-Tau at pLK, na nagmumungkahi ng mabilis na pagkawala ng mga likidong katangian sa dalawang sistemang ito.Ayon sa aming pagsusuri sa FLIM-FRET, ang mga may edad na pLK at ΔNt-Tau droplets ay nagpakita ng magkatulad na antas ng pagsasama-sama ng protina (katulad na fluorescence lifetime) bilang mga orihinal na droplet, na nagmumungkahi na ang orihinal na network ng protina ay napanatili, kahit na mas mahigpit.
Isinasakatwiran namin ang aming mga pang-eksperimentong resulta sa sumusunod na modelo (Larawan 8).Ang unang pansamantalang nabuong mga droplet ay kadalasang mga network ng protina na walang electrostatic compensation, at sa gayon ay may mga lugar ng charge imbalance, lalo na sa droplet interface, na nagreresulta sa mga droplet na may mataas na electrostatic surface potential.Upang mabayaran ang singil (isang phenomenon na karaniwang tinutukoy bilang valence depletion) at mabawasan ang potensyal sa ibabaw ng mga droplet, ang mga droplet ay maaaring magsama ng mga bagong polypeptide mula sa dilute phase, muling ayusin ang mga network ng protina upang ma-optimize ang mga pakikipag-ugnayan sa charge-charge, at makipag-ugnayan sa iba pang mga droplet.may mga ibabaw (basa).Ang mga droplet ng αS/pLK, dahil sa kanilang mas simpleng network ng protina (mga heterotypic na pakikipag-ugnayan lamang sa pagitan ng αS at pLK) at higit na pagkakaugnay para sa mga pakikipag-ugnayan ng protina-protina, ay tila mas mabilis na nababalanse ang singil ng condensate;sa katunayan, napansin namin ang mas mabilis na kinetics ng protina sa unang nabuo na αS/pLK coacervates kaysa sa αS/Tau.Pagkatapos ng valence depletion, ang mga interaksyon ay nagiging mas ephemeral at ang mga droplet ay nawawala ang kanilang mga likidong katangian at nagiging mala-gel, hindi nasusunog na mga droplet na may mababang electrostatic na potensyal sa ibabaw (at samakatuwid ay hindi mabasa ang ibabaw).Sa kabaligtaran, ang mga droplet ng αS/Tau ay hindi gaanong mahusay sa pag-optimize ng balanse ng singil ng droplet dahil sa mas kumplikadong mga network ng protina (na may parehong homotypic at heterotypic na pakikipag-ugnayan) at ang mas mahinang katangian ng mga pakikipag-ugnayan ng protina.Nagreresulta ito sa mga droplet na nagpapanatili ng likidong pag-uugali sa loob ng mahabang panahon at nagpapakita ng mataas na electrostatic na potensyal sa ibabaw na malamang na mababawasan sa pamamagitan ng pagsasama-sama at paglaki (kaya pinaliit ang surface area/volume ratio ng mga droplet) at sa pamamagitan ng pag-basa sa hydrophilic surface chem.Lumilikha ito ng malalaking konsentradong mga aklatan ng protina na nagpapanatili ng mga likidong katangian habang ang mga pakikipag-ugnayan ay nananatiling napakalilipas dahil sa patuloy na paghahanap para sa pag-optimize ng singil sa network ng protina.Kapansin-pansin, ang mga N-terminally truncated form ng Tau, kabilang ang ilang natural na nagaganap na isoform62, ay nagpapakita ng intermediate na pag-uugali, na may ilang coacervates na tumatanda kasama ang αS sa mga long-lived na mala-gel na droplet, habang ang iba ay nagbabago sa malalaking likidong condensate.Ang duality na ito sa maturation ng αS electrostatic coacervates ay naaayon sa kamakailang LLPS theoretical at experimental na pag-aaral na natukoy ang isang ugnayan sa pagitan ng valence depletion at electrostatic sieving sa condensates bilang isang susi sa pagkontrol sa laki ng condensate at fluid properties.Mekanismo 58.61.
Ipinapakita ng scheme na ito ang putative amyloid aggregation pathway para sa αS at Tau441 sa pamamagitan ng LLPS at LSPT.Sa karagdagang mga rehiyong mayaman sa anion (pula) at mayaman sa cation (asul), ang αS at tau electrostatic coacervates na may kasiya-siyang valence ay may mas mababang enerhiya sa ibabaw at samakatuwid ay mas kaunting coalescence, na nagreresulta sa mabilis na pagtanda ng droplet.Ang isang matatag na non-agglomerated gel state ay nakakamit..Ang sitwasyong ito ay napaka-kanais-nais sa kaso ng αS/pLK system dahil sa mas mataas na pagkakaugnay nito at mas simpleng network ng pakikipag-ugnayan ng protina-pares, na nagbibigay-daan para sa isang mabilis na paglipat na tulad ng gel.Sa kabaligtaran, ang mga droplet na may hindi kasiya-siyang valence at, samakatuwid, ang mga rehiyon na may protina ay magagamit para sa pakikipag-ugnayan, ginagawang mas madali para sa coacervate na mag-fuse at mabasa ang hydrophilic na ibabaw upang mabawasan ang mataas na enerhiya sa ibabaw nito.Ang sitwasyong ito ay mas kanais-nais para sa αS/Tau441 coacervates, na mayroong multivalent complex network na binubuo ng mahinang Tau-Tau at αS-Tau na pakikipag-ugnayan.Sa turn, ang mas malalaking coacervate ay mas madaling mapanatili ang kanilang mga katangiang tulad ng likido, na nagpapahintulot sa iba pang mga pakikipag-ugnayan ng protina-sa-protina na mangyari.Sa kalaunan, ang mga amyloid heterogenous na pinagsama-samang naglalaman ng parehong αS at tau ay bumubuo sa loob ng coacervate fluid, na maaaring nauugnay sa mga matatagpuan sa mga inclusion body, na mga palatandaan ng mga sakit na neurodegenerative.
Ang malalaking istrukturang tulad ng likido na nabuo sa panahon ng pagkahinog ng αS/Tau441 na may lubos na masikip ngunit dinamikong kapaligiran ng protina at, sa mas mababang lawak, ang αS/ΔNt-Tau coacervates ay mainam na mga reservoir para sa nucleation ng pagsasama-sama ng protina.Talagang napansin namin ang pagbuo ng mga solidong pinagsama-samang protina sa ganitong uri ng mga coacervates ng protina, na madalas na naglalaman ng parehong αS at tau.Ipinakita namin na ang mga heteroaggregate na ito ay nagpapatatag ng mga non-electrostatic na pakikipag-ugnayan, nagagawang magbigkis ng amyloid-specific ThT dyes sa parehong paraan tulad ng mga tipikal na amyloid fibrils, at sa katunayan ay may katulad na pagtutol sa iba't ibang mga impluwensya.Ang mga pinagsama-samang αS/tau na nabuo ng LLPS ay ipinakita na may mga katangiang tulad ng amyloid.Sa katunayan, ang mature na variant ng Tau na kulang sa amyloid aggregation ay makabuluhang may kapansanan sa pagbuo ng mga heterogenous na αS aggregates na ito sa loob ng likidong electrostatic coacervate.Ang pagbuo ng mga pinagsama-samang αS/Tau441 ay naobserbahan lamang sa loob ng mga coacervates, na nagpapanatili ng mga katangiang tulad ng likido, at hindi kailanman, kung ang mga coacervates/droplet ay hindi umabot sa estado ng gel.Sa huling kaso, ang tumaas na lakas ng mga pakikipag-ugnayan ng electrostatic at, bilang isang resulta, ang katigasan ng network ng protina ay pumipigil sa mga kinakailangang pagbabago ng conformational ng mga protina upang magtatag ng mga bagong pakikipag-ugnayan ng protina na kinakailangan para sa amyloid nucleation.Gayunpaman, ito ay maaaring makamit sa mas nababaluktot, tulad ng likidong mga coacervate, na kung saan ay mas malamang na manatiling likido habang lumalaki ang mga ito sa laki.
Ang katotohanan na ang pagbuo ng mga aggregate sa loob ng condensed phase ay mas kanais-nais sa malalaking αS/Tau condensates kaysa sa maliliit na droplet na mabilis na nag-gel, ay binibigyang-diin ang kaugnayan ng pagtukoy sa mga salik na kumokontrol sa droplet coalescence.Kaya, hindi lamang mayroong isang ugali para sa paghihiwalay ng bahagi, ngunit ang laki ng condensate ay dapat kontrolin para sa wastong paggana pati na rin ang pag-iwas sa sakit58,61.Itinatampok din ng aming mga resulta ang kahalagahan ng balanse sa pagitan ng LLPS at LSPT para sa αS/Tau system.Habang ang pagbuo ng droplet ay maaaring maprotektahan laban sa pagsasama-sama ng amyloid sa pamamagitan ng pagbabawas ng dami ng mga monomer ng protina na magagamit sa ilalim ng mga kondisyon ng saturation, tulad ng iminungkahi sa iba pang mga system63, 64, ang pagsasanib ng droplet sa mataas na antas ng droplet ay maaaring humantong sa panloob na pagsasama-sama ng protina sa pamamagitan ng mabagal na pag-aayos ng conformational.mga network ng protina..
Sa pangkalahatan, mariing binibigyang-diin ng aming data ang kaugnayan ng magkakaugnay na valence at nasiyahan/hindi nasisiyahang mga pakikipag-ugnayan sa mga drop network sa konteksto ng LSPT.Sa partikular, ipinapakita namin na ang full-length na αS/Tau441 condensates ay may kakayahang mag-fuse at nucleate upang bumuo ng amyloid-like heteroaggregates na kinabibilangan ng parehong mga protina at nagmumungkahi ng isang molekular na mekanismo batay sa aming mga eksperimentong resulta.Ang co-aggregation ng dalawang protina sa αS/Tau fluid coacervate na iniulat namin dito ay maaaring may kaugnayan talaga sa co-localization ng dalawang protina sa mga inklusyon, na mga palatandaan ng sakit, at maaaring mag-ambag sa pag-unawa sa ugnayan sa pagitan ng LLPS at amyloid aggregation, na nagbibigay daan para sa mataas na sisingilin na IDP sa neurodegeneration.
Ang mga monomeric WT-αS, cysteine ​​​​mutants (Q24C-αS, N122C-αS) at ΔCt-αS na mga variant (Δ101-140) ay ipinahayag sa E. coli at nadalisay tulad ng naunang inilarawan.Ang 5 mM DTT ay kasama sa lahat ng mga hakbang sa paglilinis ng αS cysteine ​​​​mutants upang maiwasan ang pagbuo ng disulfide bond.Tau441 isoform (plasmid na nakuha mula sa Addgene #16316), ΔNt-Tau variant (Δ1–150, na nakuha sa pamamagitan ng pag-clone ng IVA na may mga primer na CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) at AggDef-Tau na variant na may EGC1275 na panimulang primera ng kultura (1ΔTC5-Tau). lumaki sa OD600 = 0.6-0.7 sa 37 ° C at 180 rpm, at ang expression ay naimpluwensyahan ng IPTG sa loob ng 3 oras sa 37 ° C.I-harvest ang mga cell sa 11,500 xg sa loob ng 15 min sa 4 °C at hugasan gamit ang saline buffer na naglalaman ng 150 mM NaCl.Isuspinde muli ang pellet sa lysis buffer (20 ml bawat 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 100).Ang sonication step ay isinagawa sa yelo na may amplitude na 80% para sa 10 pulses (1 min on, 1 min off).Huwag lumampas sa 60 ML sa isang ultrasound.Ang E. coli lysates ay pinainit sa 95° C. sa loob ng 20 minuto, pagkatapos ay pinalamig sa yelo at na-centrifuge sa 127,000×g sa loob ng 40 minuto.Ang nilinaw na supernatant ay inilapat sa isang 3.5 kDa lamad (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, UK) at na-dialyze laban sa 4 L ng dialysis buffer (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2mM , PMSF 0.1 mM) sa loob ng 10 oras.Ang isang 5 ml cation exchange column (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) ay na-equilibrate sa equilibration buffer (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Ang tau lysate ay na-filter sa pamamagitan ng isang 0.22 μm PVDF filter at iniksyon sa haligi sa isang rate ng daloy na 1 ml / min.Ang elution ay unti-unting isinagawa, ang tau ay na-eluted na may 15-30% elution buffer (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Ang mga praksyon ay sinuri ng SDS-PAGE, at anumang mga praksyon na naglalaman ng isang banda na may inaasahang molekular na timbang ng tau ay puro gamit ang isang 10 kDa centrifuge filter at pinalitan ng buffer na naglalaman ng 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM at DTT 2 mM para sa ang panghuling konsentrasyon ng protina ay 100 μM.Ang solusyon ng protina ay pagkatapos ay dumaan sa isang 0.22 μm PVDF filter, mabilis na nagyelo at nakaimbak sa -80°C.Ang Protein K18 ay magiliw na ibinigay ni Prof. Alberto Boffi.Ang kadalisayan ng paghahanda ay> 95% na kinumpirma ng SDS-PAGE at MALDI-TOF/TOF.Ang iba't ibang mga cysteine ​​ay may label na kemikal na may AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) o TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).ay nakumpirma ng absorbance at MALDI-TOF/TOF.Ang Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau at K18 ay may label na may katutubong cysteine ​​​​residues sa mga posisyon 191 at 322 gamit ang Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany) kasunod ng parehong pamamaraan.Ang netong singil sa bawat residue na mapa para sa αS at Tau441 ay nabuo gamit ang CIDER66.
Ang solid poly-L-lysine (pLK DP 90-110 ayon sa NMR mula sa supplier, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) ay natunaw sa 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 hanggang 10 mM na konsentrasyon, proseso ng sonicated para sa 5 minuto sa isang ultrasonic water bath at mag-imbak sa -20°C.Ang PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) at FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) ay nalulusaw sa tubig at malawak na ipinamamahagi sa LLPS buffer.Tinatanggal ng dialysis ang mga kontaminadong asin.Pagkatapos ay na-filter sila sa pamamagitan ng isang filter ng syringe na may sukat ng butas na 0.22 μm, at ang kanilang mga konsentrasyon ay kinakalkula gamit ang isang refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Ang mga sample ng LLPS ay inihanda sa temperatura ng silid sa sumusunod na pagkakasunud-sunod: pinaghalo ang buffer at extrusion at 1 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic acid (EDTA, carboxynth) at isang halo ng 1% protease inhibitor (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Pagkatapos ay idinagdag ang αS at fused polycations (mga opsyon pLK o Tau).Para sa mga eksperimento ng time series ng thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), gamitin ang kabuuang konsentrasyon ng ThT upang maging kalahati ng konsentrasyon ng αS.Dahan-dahan ngunit lubusang paghaluin ang mga sample upang matiyak na homogenous ang mga ito.Ang konsentrasyon ng bawat bahagi ay nag-iiba mula sa eksperimento hanggang sa eksperimento, tulad ng inilarawan sa seksyong Mga Resulta.Ang Azide ay ginamit sa isang konsentrasyon na 0.02% (w/v) sa tuwing ang tagal ng eksperimento ay lumampas sa 4 na oras.Para sa lahat ng pagsusuri gamit ang mga sample ng LLPS, payagan ang timpla na mag-equilibrate sa loob ng 5 minuto bago ang pagsusuri.Para sa light scattering analysis, 150 µl ng mga sample ang ni-load sa non-binding 96-well microplate (µClear®, black, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) at tinakpan ng adhesive film.Ang mga LLP ay sinusubaybayan sa pamamagitan ng pagsukat ng absorbance sa 350 nm sa gitna ng solusyon sa isang CLARIOstar plate reader (BMG Labtech, Ortenberg, Germany).Ang mga eksperimento ay isinagawa sa triplicate sa 25°C, at ang mga error ay kinakalkula bilang karaniwang paglihis mula sa mean.Ang dilute phase ay na-quantified sa pamamagitan ng sample centrifugation at SDS-PAGE gel analysis, at ang αS fraction sa dilute at concentrated phase ay na-quantified sa iba't ibang LLPS solutions.Ang isang 100 μl LLPS sample na naglalaman ng 1 μM AF488 na may label na αS ay inihanda sa pamamagitan ng masusing paghahalo na sinusundan ng centrifugation sa 9600 × g para sa 30 minuto, pagkatapos kung saan ang precipitate ay karaniwang nakikita.Ang nangungunang 50 μl ng supernatant ay ginamit para sa dami ng protina gamit ang SDS-PAGE gel.Ang mga gel ay na-scan gamit ang mga filter ng AF488 gamit ang isang ChemiDoc gel imaging system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) o nabahiran ng Coomassie stain at na-visualize gamit ang naaangkop na mga filter.Ang mga nagresultang banda ay nasuri gamit ang ImageJ na bersyon 1.53i (National Institutes of Health, USA).Ang mga eksperimento ay isinagawa nang doble sa dalawang magkaibang mga eksperimento na may magkatulad na mga resulta.
Karaniwan, 150 μl ng mga sample ang inilapat sa hindi nagbubuklod na 96-well microplates at na-visualize sa temperatura ng silid sa isang Leica DMI6000B inverted microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).Para sa mga eksperimento sa lugar, ginamit din ang mga µ-Slide Angiogenesis plate (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) o 96-well polystyrene microplate (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Ang EL6000 halogen o mercury metal halide lamp ay ginamit bilang illumination sources (para sa BF/DIC at WF imaging, ayon sa pagkakabanggit).Para sa WF microscopy, ginamit ang 40x magnification air objective (Leica Microsystems, Germany) para ituon ang liwanag sa sample at kolektahin ito.Para sa mga sample na may label na AF488 at ThT, i-filter ang excitation at emission na may mga standard na set ng filter ng GFP, mga filter na bandpass ng excitation at emission, ayon sa pagkakabanggit, 460–500 nm at 512–542 nm bandpass filter, at isang 495 nm dichroic mirror.Para sa mga sample na may label na Atto647N, isang karaniwang hanay ng mga filter ng Cy5 na may mga filter ng paggulo at paglabas ng bandpass na 628-40 nm at 692-40 nm, ayon sa pagkakabanggit, at ginamit ang isang 660 nm dichroic mirror.Para sa BF at DIC microscopy, gamitin ang parehong layunin sa pagkolekta ng reflected light.Ang nakolektang ilaw ay naitala sa isang Leica DFC7000 CCD camera (Leica Microsystems, Germany).Ang oras ng pagkakalantad ay 50 ms para sa BF at DIC microscopy imaging at 20-100 ms para sa WF microscopy imaging.Para sa paghahambing, ang oras ng pagkakalantad para sa lahat ng mga eksperimento sa ThT ay 100 ms.Ang mga eksperimento sa time-lapse ay isinagawa upang mailarawan ang droplet coalescence, na may mga imahe na kinokolekta bawat 100 ms sa loob ng ilang minuto.Ang ImageJ (NIH, USA) ay ginamit para sa pagsusuri ng imahe.Ang mga eksperimento ay isinagawa sa triplicate na may katulad na mga resulta.
Para sa mga eksperimento sa colocalization, FRAP at 3D reconstruction, ang mga imahe ay nakuha sa isang Zeiss LSM 880 inverted confocal microscope gamit ang isang ZEN 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).Ang mga sample ng 50 µl ay inilapat sa µ-Slide Angiogenesis Petri dishes (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Germany), ginagamot sa isang hydrophilic polymer (ibiTreat) at inilagay sa isang 63× oil immersion na layunin (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) sa DIC).Ang mga imahe ay nakuha gamit ang 458 nm, 488 nm, at 633 nm argon laser lines na may resolution na 0.26 µm/pixel at isang exposure time na 8 µs/pixel para sa excitation at emission detection windows na 470–600 nm, 493–628 nm, at 638–755 nm ay ginamit upang mailarawan ang ThT, AF488 at Atto647N, ayon sa pagkakabanggit.Para sa mga eksperimento ng FRAP, ang time-lapse photography ng bawat sample ay naitala sa 1 frame bawat segundo.Ang mga eksperimento ay isinagawa sa triplicate sa temperatura ng silid na may katulad na mga resulta.Ang lahat ng mga imahe ay nasuri gamit ang Zen 2 blue edition software (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).Ang mga curve ng FRAP ay na-normalize, na-plot at nilagyan ng data ng intensity/time na nakuha mula sa mga larawan gamit ang Zen 2 gamit ang OriginPro 9.1.Ang mga curve sa pagbawi ay inilagay sa isang mono-exponential na modelo upang isaalang-alang ang pagsasabog ng molekular na may karagdagang terminong exponential upang i-acquisition ang epekto ng pagpapaputi ng pagkuha.Pagkatapos ay kinakalkula namin ang D gamit ang nominal bleaching radius at ang dating natukoy na kalahating buhay ng pagbawi tulad ng sa equation ng Kang et al.5 35 ipinapakita.
Ang mga solong cysteine ​​​​variant ng αS ay na-synthesize ng 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) sa mga posisyon 24 (TEMPOL-24-αS) at 122 (TEMPOL-122-αS), ayon sa pagkakabanggit.Spin Labeling Para sa mga eksperimento sa EPR, ang konsentrasyon ng αS ay itinakda sa 100 μM at ang konsentrasyon ng PEG ay 15% (w/v).Para sa iba't ibang mga kondisyon ng pagsasama-sama, ang αS:pLK ratio ay 1:10, habang ang αS:ΔNt-Tau at αS:Tau441 ratio ay pinananatili sa 1:1.Para sa mga nagbubuklod na mga eksperimento sa titration sa kawalan ng pagsisikip, ang TEMPOL-122-αS ay pinananatili sa 50 μM at ang mga polycation ay na-titrate sa pagtaas ng mga konsentrasyon, inihahanda ang bawat kondisyon nang hiwalay.Ang mga pagsukat ng CW-EPR ay isinagawa gamit ang isang Bruker ELEXSYS E580 X-band spectrometer na nilagyan ng isang Bruker ER4118 SPT-N1 resonator na tumatakbo sa dalas ng microwave (SHF) na ~9.7 GHz.Ang temperatura ay itinakda sa 25°C at kinokontrol ng isang liquid nitrogen cryostat.Ang spectra ay nakuha sa ilalim ng mga unsaturated na kondisyon sa isang MW na kapangyarihan na 4 mW, isang modulation amplitude na 0.1 mT, at isang modulation frequency na 100 kHz.Ang mga spectral intensity ay na-normalize upang maiwasan ang mga pagkakaiba-iba sa mga konsentrasyon ng spin sa pagitan ng mga sample at posibleng pagbawas ng pag-ikot dahil sa mga natitirang konsentrasyon ng pagbabawas ng mga ahente sa mga sample na naglalaman ng Tau441 o ΔNt-Tau (naroroon sa orihinal na mga solusyon sa protina).Ang mga ibinigay na halaga ng g ay nakuha bilang resulta ng EPR spectral modeling na isinagawa gamit ang Easyspin software (v. 6.0.0-dev.34) na ipinatupad sa Matlab®67.Isa/dalawang bahagi na isotropic na modelo ang ginamit upang imodelo ang data.Matapos ma-normalize ang lahat ng mga signal, ang mga nalalabi ay kinakalkula sa pamamagitan ng pagbabawas ng bawat simulation mula sa kaukulang spectrum ng eksperimentong.Para sa nagbubuklod na pagsusuri sa titration, ang kamag-anak na intensity ng ikatlong banda sa pangalawang banda ng normalized na spectrum ng EPR (IIII/III) ay ginamit upang subaybayan ang pagbubuklod ng mga polycation sa αS.Upang matantya ang dissociation constant (Kd), ang resultang curve ay nilagyan ng tinatayang modelo na ipinapalagay n magkapareho at independiyenteng nagbubuklod na mga site.
Ang mga eksperimento sa NMR spectroscopy ay isinagawa gamit ang isang Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spectrometer na nilagyan ng cryoprobe at Z-gradient.Ang lahat ng mga eksperimento ay isinagawa gamit ang 130–207 µM αS at kaukulang αS/ΔNt-Tau at pLK na katumbas sa 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 at isinagawa sa 15°C.Upang masubaybayan ang LPS ng NMR, 10% PEG ang idinagdag sa mga pre-mixed na sample.Ang chemical shift perturbation plot (Fig. 1b) ay nagpapakita ng average na 1H at 15N na chemical shift.Ang αS 2D1H-15N HSQC spectra ay itinalaga batay sa isang nakaraang takdang-aralin (BMRB entry #25227) at nakumpirma sa pamamagitan ng pag-record at pagsusuri ng 3D spectra ng HNCA, HNCO at CBCAcoNH.Ang 13Cα at 13Cβ na mga pagbabago sa kemikal ay kinakalkula sa pagkakaroon ng ΔNt-Tau o pLK upang masukat ang mga posibleng pagbabago sa pangalawang mga uso sa istraktura kumpara sa mga pagbabago sa kemikal ng αS sa purong random na coil conformation 68 (Karagdagang Larawan 5c).Ang mga rate ng R1ρ ay sinusukat sa pamamagitan ng pagtatala ng mga eksperimento ng hsqctretf3gpsi (nakuha mula sa aklatan ng Bruker) na may mga pagkaantala ng 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, at 800 ms, at ang mga exponential function ay nababagay sa mga peak intensity delay. beses upang matukoy ang R1ρ at ang pang-eksperimentong kawalan ng katiyakan nito.
Ang dalawang kulay na time-resolved fluorescence microscopy na mga eksperimento ay isinagawa sa isang commercial time-resolved MT200 fluorescence confocal microscope (PicoQuant, Berlin, Germany) na may time-correlated na solong photon counting (TCSPC) na device.Ang laser diode head ay ginagamit para sa pulsed interleaved excitation (PIE), ang beam ay dumadaan sa isang solong mode waveguide at nakatutok sa isang laser power na 10 hanggang 100 nW para sa 481 nm at 637 nm laser lines na sinusukat pagkatapos ng isang dichroic mirror.Tinitiyak nito ang pinakamainam na rate ng pagbibilang ng photon, pag-iwas sa mga epekto ng photon aliasing, photobleaching at saturation.Ang μ-Slide angiogenesis coverslips o plates (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) ay direktang inilagay sa immersion water sa ibabaw ng Super Apochromat 60x NA 1.2 lens na may corrective collar (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Ang isang 488/640 nm dichroic mirror (Semrock, Lake Forest, IL, USA) ay ginamit bilang pangunahing beam splitter.Ang hindi nakatutok na radiation ay hinaharangan ng isang butas na may diameter na 50 microns, pagkatapos ay ang nakatutok na radiation ay nahahati sa 2 mga landas ng pagtuklas ng isang 50/50 beam splitter.Ang mga filter ng paglabas ng Bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 para sa berdeng tina (AF488) at 690/70 para sa pulang tina (Atto647N) ay ginamit sa harap ng detektor.Ang single-photon avalanche diodes (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italy) ay ginamit bilang mga detektor.Ang parehong pagkolekta at pagsusuri ng data ay isinagawa gamit ang komersyal na magagamit na SymphoTime64 software (PicoQuant GmbH, Berlin, Germany).
Limampung microliter ng mga sample ng LLPS ang inilapat sa mga balon ng μ-Slide angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany).Ang mga resultang larawan ay nakatutok sa 20 µm sa itaas ng ilalim ng balon para sa pinakamainam na layuning distansya ng pagtatrabaho para sa mga sinuspinde na droplet at hanggang ~1 µm para sa mga balsa at tuldok na may axial resolution na hindi bababa sa 0.25 µm/pixel at isang oras ng pagkaantala na 400 µs/pixel.Pumili ng data sa pamamagitan ng paglalapat ng intensity threshold batay sa average na background signal intensity (PBG, mean + 2σ) para sa bawat channel upang ang mga liquid protein droplet, raft, o spots lang ang napili, na sinasala ang anumang posibleng pinagmulan mula sa dispersed phase.Upang pag-aralan ang habang-buhay ng bawat species (τ) ng bawat channel (berde, "g" para sa AF488 at pula, "r" para sa Atto647N), pinili namin ang mga rehiyon ng interes (ROI) na naglalaman ng mga droplet, raft, o mga spot (Karagdagang Larawan 1 ).8b) at hinango ang mga ito sa pamamagitan ng pag-angkop sa kanilang panghabambuhay na pagkabulok (τD, τR at τP para sa mga droplet, balsa o mga spot, ayon sa pagkakabanggit, tingnan ang Karagdagang Fig. 8c) sa bawat channel gamit ang isang pagsusuri sa tail-fit at isang modelo ng dalawang sangkap na pagkabulok.Average na τ mula sa τ .Ang ROI na gumawa ng masyadong kaunting mga photon para sa isang multi-exponential fit ay hindi kasama sa pagsusuri.Ang cutoff na ginamit ay <104 photon para sa mga balsa at tuldok at 103 para sa mga patak.Ang mga droplet ay may mas mababang threshold dahil mahirap makakuha ng mga decay curve na may mas mataas na mga halaga ng intensity, dahil ang mga droplet sa field ng imahe ay kadalasang mas maliit at mas kaunti.Ang mga ROI na may mga bilang ng photon na higit sa limitasyon sa pag-iipon ng photon (itinakda sa >500 na bilang/pixel) ay itinapon din para sa pagsusuri.Itugma ang intensity decay curve na nakuha mula sa rehiyon ng interes na may intensity sa 90% ng maximum (bahagyang pagkatapos ng maximum intensity ng decay) mula sa simula ng buhay ng serbisyo upang matiyak ang minimal na interference ng IRF habang pinapanatili ang pareho para sa lahat ng intensity decay setting Relative time window Sinuri ng 25 hanggang 50 ROI para sa mga raft at spot at 15-25 ROI para sa mga drop, mga larawang pinili mula sa higit sa 4 na mga replika na naitala mula sa hindi bababa sa 3 independiyenteng mga eksperimento.Ang dalawang-tailed t-test ay ginamit upang suriin ang mga pagkakaiba sa istatistika sa pagitan ng mga species o sa pagitan ng mga coacervate system.Para sa isang pixel-by-pixel analysis ng lifetime (τ), ang kabuuang attenuation ng lifetime sa field para sa bawat channel ay kinakalkula at isang approximation ng isang 2/3-component exponential attenuation model ang isinagawa.Ang panghabambuhay na attenuation para sa bawat pixel ay nilagyan ng dating nakalkulang mga halaga ng τ, na nagreresulta sa isang pseudocolor FLIM fit na imahe.Ang tail-fit lifetime range ay pareho sa lahat ng larawan ng parehong channel, at ang bawat decay ay gumawa ng sapat na mga photon upang makapagbigay ng maaasahang fit.Para sa pagsusuri ng FRET, pinili ang mga pixel sa pamamagitan ng paglalapat ng mas mababang intensity threshold na 100 photon, na nag-average ng background signal (FBG) na 11 photon.Ang intensity ng fluorescence ng bawat channel ay naitama sa pamamagitan ng eksperimento na tinutukoy na mga kadahilanan ng pagwawasto: 69 spectral crosstalk α ay 0.004, direktang paggulo β ay 0.0305, ang kahusayan ng pagtuklas γ ay 0.517.Ang kahusayan ng FRET sa antas ng pixel ay kinakalkula gamit ang sumusunod na equation:
kung saan ang FDD ay ang fluorescence intensity na sinusunod sa donor (berde) channel, ang FDA ay ang fluorescence intensity na sinusunod sa acceptor (pula) channel sa ilalim ng hindi direktang paggulo, at FAA ay ang fluorescence intensity na sinusunod sa acceptor (pula) channel sa ilalim ng direktang paggulo ( PIE).Ang fluorescence intensity pulses ay sinusunod sa channel).
Maglagay ng 100 µl ng LLPS reaction solutions na naglalaman ng 25 µM na walang label na monomeric Tau441 (mayroon o walang 25 µM αS) sa LLPS buffer (suplemento tulad ng nasa itaas) sa hindi nagbibigkis na 96-well microplate na may adhesive foil coating at droplet formation ay nasuri ng WF micros pagkakapantay-pantay.sa loob ng 10 min.Pagkatapos ng 48 oras ng pagpapapisa ng itlog sa temperatura ng silid, ang pagkakaroon ng mga raft ng protina at mga spot ay nakumpirma.Pagkatapos ay maingat na alisin ang likido sa ibabaw ng mga balsa mula sa mga balon, pagkatapos ay magdagdag ng 50 L ng dissociation buffer (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) at i-incubate sa loob ng 10 min.Tinitiyak ng mataas na konsentrasyon ng asin na hindi mauulit ang LLPS dahil sa natitirang PEG, at ang mga posibleng pagtitipon ng protina na nabuo lamang sa pamamagitan ng mga electrostatic na pakikipag-ugnayan ay kakalas-kalasin.Ang ilalim ng balon ay pagkatapos ay maingat na kinamot ng isang micropipette tip at ang nagresultang solusyon ay inilipat sa isang walang laman na balon ng pagmamasid.Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog ng mga sample na may 50 μM ThT para sa 1 h, ang pagkakaroon ng mga nakahiwalay na spot ay sinuri ng WF microscopy.Maghanda ng sonicated αS fibrils sa pamamagitan ng pagpapapisa ng 300 µl ng 70-µM αS solution sa PBS na may pH 7.4, sodium azide 0.01% sa 37 °C at 200 rpm sa isang orbital shaker sa loob ng 7 araw.Ang solusyon ay pagkatapos ay centrifuged sa 9600 × g para sa 30 min, ang pellet ay muling sinuspinde sa PBS pH 7.4 at sonicated (1 min, 50% cycle, 80% amplitude sa isang Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) fibril sample na may medyo pare-parehong laki ng pamamahagi ng maliliit na fibrils.
Ang pagsusuri sa FCS/FCCS at two-color coincidence detection (TCCD) ay isinagawa sa parehong MT200 time-resolved fluorescent confocal microscope (Pico-Quant, Berlin, Germany) na ginamit para sa FLIM-FRET microscopy na mga eksperimento gamit ang PIE mode.Ang lakas ng laser para sa mga eksperimentong ito ay idinagdag sa 6.0 µW (481 nm) at 6.2 µW (637 nm).Ang kumbinasyon ng mga kapangyarihan ng laser na ito ay pinili upang makagawa ng katulad na liwanag para sa mga pares ng fluorophores na ginamit habang nakakamit ang pinakamainam na mga rate ng pagbilang at pag-iwas sa photobleaching at saturation.Ang parehong pagkolekta at pagsusuri ng data ay isinagawa gamit ang komersyal na magagamit na SymphoTime64 na bersyon 2.3 software (PicoQuant, Berlin, Germany).
Ang mga sample ng isolated αS/Tau aggregates na nakuha gamit ang LLPS ay diluted in isolation buffer sa naaangkop na monomolecular concentration (karaniwan ay isang 1:500 dilution, dahil ang mga aggregate ay nasa mababang konsentrasyon na kapag nahiwalay sa mga coacervate sample).Ang mga sample ay direktang inilapat sa mga coverslip (Corning, USA) na pinahiran ng isang BSA solution sa konsentrasyon na 1 mg/mL.
Para sa pagsusuri ng PIE-smFRET sa berde at pula na mga channel, ang isang mas mababang intensity threshold ng 25 photon ay inilapat upang i-filter ang mababang intensity signal na dulot ng mga monomeric na kaganapan (tandaan na ang mga monomer ay mas marami sa mga pinagsama-samang sample kumpara sa mga nakahiwalay na pinagsama-samang).Ang threshold na ito ay kinakalkula bilang limang beses ang average na intensity ng monomeric αS na nakuha mula sa pagsusuri ng mga purong monomer sample upang partikular na pumili ng mga pinagsama-samang para sa pagsusuri.Ang PIE drive circuit, kasama ng TSCPC data acquisition, ay nagpagana ng aplikasyon ng panghabambuhay na weighting filter na tumutulong sa pag-alis ng background at spectral crosstalk.Ang intensity ng flare na pinili gamit ang mga threshold sa itaas ay naitama gamit ang average na background signal na tinutukoy mula sa histograms ng paglitaw kumpara sa intensity/bin ng mga buffer-only na sample.Ang mga pagsabog na nauugnay sa malalaking aggregate ay karaniwang sumasakop sa ilang magkakasunod na bin sa time trace (nakatakda sa 1 ms).Sa mga kasong ito, napili ang bin ng pinakamataas na lakas.Para sa pagsusuri ng FRET at stoichiometric, ginamit ang teoretikal na tinukoy na gamma factor γ (0.517).Ang spectral crosstalk at direktang excitation na kontribusyon ay bale-wala (natukoy sa eksperimentong paraan) sa paggamit ng excitation laser power.Ang kahusayan at stoichiometry ng FRET sa isang pagsabog ay kinakalkula bilang mga sumusunod.