347 stainless steel coiled tubing chemical component ,Pagkilala ng nobelang interferon-responsive human leukocyte antigen-A (HLA-A) na mga chaperone protein gamit ang cross-linked mass spectrometry (CLMS)

Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Gumagamit ka ng bersyon ng browser na may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Bilang karagdagan, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipinapakita namin ang site na walang mga istilo at JavaScript.
Mga slider na nagpapakita ng tatlong artikulo sa bawat slide.Gamitin ang likod at susunod na mga pindutan upang lumipat sa mga slide, o ang mga pindutan ng slide controller sa dulo upang lumipat sa bawat slide.

Paglalarawan ng Produkto

Hindi kinakalawang na asero 347L Coil Tube, Steel Grade: SS347L

Ang interferon signaling system ay nagpapahiwatig ng isang malakas na tugon ng cytokine sa isang malawak na hanay ng mga pathogenic at intrinsic na pathological signal mula sa kapaligiran, na nagreresulta sa induction ng mga subset ng interferon-inducible na mga protina.Inilapat namin ang DSS-mediated cross-link mass spectrometry (CLMS) upang makita ang mga bagong pakikipag-ugnayan ng protina-protina sa domain ng mga interferon-induced na protina.Bilang karagdagan sa inaasahang interferon-inducible protein, natukoy din namin ang nobelang intermolecular at intramolecular na cross-linked na mga addduct ng canonical interferon-inducible na protina tulad ng MX1, USP18, OAS3, at STAT1.Nakatuon kami sa orthogonal validation ng isang nobelang set ng interferon-inducible protein network na nabuo ng HLA-A proteins (H2BFS-HLA-A-HMGA1) gamit ang co-immunoprecipitation at ang kanilang karagdagang pag-aaral gamit ang molecular dynamics modeling.Ang pagmomodelo ng conformational dynamics ng protein complex ay nagsiwalat ng ilang mga site ng pakikipag-ugnayan na sumasalamin sa mga pakikipag-ugnayan na natukoy sa mga natuklasan ng CLMS.Sama-sama, nagpapakita kami ng isang pilot na pag-aaral ng CLMS upang matukoy ang mga bagong signaling complex na dulot ng interferon, at inaasahan ang mas malawak na paggamit ng CLMS upang matukoy ang mga bagong dynamics ng mga pakikipag-ugnayan ng protina sa tumor microenvironment.
Bago magsimula ang isang adaptive immune response, ang likas na sistema ng pagtatanggol ng host ay naglalagay ng isang antimicrobial na tugon na pinapamagitan ng isang pamilya ng mga sikretong alpha-helical cytokine na tinatawag na interferon (IFNs).Ang mga klase ng IFN na uri I IFNα at IFNβ ay nag-a-activate ng mga cellular response, kabilang ang mga antiviral, proapoptotic, proinflammatory, at antiproliferative na estado.Sa mga tao, 13 subtype ng IFNα ang kilala, lahat ay naka-cluster sa chromosome 91. Nakakagulat, ang IFNα2 lang ang napag-aralan para sa klinikal na paggamit.Kamakailan, binigyan ng espesyal na atensyon ang pagsasaliksik sa iba pang mga subtype ng IFNα.Ang isang kamakailang pag-aaral ay nagpakita na ang IFNα14 ay isa sa mga pinakaepektibong isoform sa paghihigpit sa HBV2 at HIV-13,4 na pagtitiklop kumpara sa canonical IFNα2 subtype.
Ito ay itinatag na ang activated type I interferon receptor complexes (IFNAR1 at IFNAR2) ay nag-trigger ng isang signal transduction cascade na pinagsama ng Janus kinases TYK2 at JAK15,6.Ang mga Janus kinases na ito ay phosphorylate signal transducers at transcriptional protein activators (STAT1 at STAT2) sa tyrosine residues upang simulan ang SH2 domain-mediated heterodimerization6.Kasunod nito, ang IRF9 ay nagbubuklod sa STAT heterodimer upang bumuo ng isang trimeric complex ng IFN-stimulated factor 3 gene (ISGF3), na nagsasalin sa nucleus at hinihimok ang transkripsyon ng higit sa 2000 interferon-stimulated genes (ISGs)5,6,7,8.
Ang mga ISG ay bumubuo sa gulugod ng likas na immune system, lalo na bilang tugon sa pag-atake ng viral.Bilang unang linya ng depensa laban sa impeksyon sa viral, ang mga cell ay mabilis na nag-deploy ng malawak na pakikipag-ugnayan ng mga cellular protein na may malawak na hanay ng mga biological na aktibidad.Kasama sa mga protina na ito ang mga pattern recognition receptor, signaling molecule, transcription factor, at mga protina na may direktang antiviral function, pati na rin ang mga negatibong regulator ng immune response9.Karamihan sa impormasyon sa aktibidad ng ISG ay nagmumula sa mga functional na screen gamit ang mga overexpression na screen10,11 o gene silencing techniques (siRNA, RNAi at CRISPR)12,13 kung saan ang mga indibidwal na ISG ay ipinahayag o pinipigilan at ang kanilang aktibidad ay sinusuri sa iba't ibang mga virus.Bagaman natukoy ng mga pag-aaral na ito ang mga katangian ng antiviral ng mga indibidwal na ISG, ang pinagbabatayan na mga mekanismo ng molekular ng bawat ISG ay nananatiling hindi alam.Karaniwang tinatanggap na maraming mga protina ang nakikipag-ugnayan sa isa o higit pang mga cytokine upang matiyak ang buong aktibidad, kaya ang alinman sa mga ISG ay direktang nakikipag-ugnayan o ang kanilang mga pakikipag-ugnayan ay pinapamagitan ng mga cellular na protina.Halimbawa, ang isang kamakailang pag-aaral ng photocrosslinked proteomics ay nakilala ang ATPase VCP/p97 bilang isang pangunahing kasosyo sa pakikipag-ugnayan ng IFITM3, na ang pagsugpo ay humahantong sa mga depekto sa lysosomal sorting, turnover, at cotransport ng IFITM3 na may mga viral particle 14 .Gamit ang immunoprecipitation, natukoy namin ang VAPA, isang vesicle-associated protein, bilang isang kasosyo sa pakikipag-ugnayan sa IFITM1/2/3 na namamagitan sa cholesterol-mediated viral maturation, at ito ay nakumpirma ng isa pang pag-aaral gamit ang yeast two-hybrid system.Scientific Support 15 , 16 .
Ang isang pangunahing biological na proseso na kasangkot sa pagsugpo sa impeksyon at malignant na pagbabago ay ang pagtatanghal ng antigen, na pinapamagitan ng mga pangunahing molekula ng histocompatibility complex (MHC).Ang mga peptide (8-12 amino acids ang haba) mula sa mga cleaved, prematurely terminated o misfolded proteins ay nilo-load sa MHC-I heterodimer (binubuo ng MHC-I heavy at light chain, na tinatawag na β-2-microglobulin; β2M) 17,18 .Ang nagreresultang matatag na mga trimer ng MHC-I ay dinadala sa ibabaw ng cell, kung saan ipinapakita nila ang mga intracellular peptides sa CD8+ T cells (cytotoxic T cells)17.Kinikilala at sinisira ng mga T cell ang mga pathogen na ito at mga cell na nagdadala ng antigen na partikular sa tumor.Dahil dito, madalas na pinipigilan ng mga pathogen at mga selula ng tumor ang proseso ng pagtatanghal ng antigen upang maiwasan ang pagsubaybay sa immune.Bilang karagdagan, ang MHC-I ay binabawasan ang regulasyon sa 40-90% ng mga tumor ng tao at kadalasang nauugnay sa isang mas mahinang pagbabala19.
Ang mga gene na kasangkot sa pagtugon sa mga pathogen ay dapat na mabilis na lumipat sa pagitan ng isang estado ng pahinga at isang estado ng aktibong transkripsyon.Samakatuwid, ang ilang mga cellular protein ay na-hypothesize na kasangkot sa pagtugon sa mataas na demand ng IFN sa maikling panahon, kabilang ang remodeling at pagbabago ng promoter chromatin 20,21 .Karamihan sa mga pag-aaral ay nakatuon sa pagkilala sa mga indibidwal na kasosyo sa protina ng ISG sa pagkakaroon ng IFN.Maraming proteomic at transcriptomic na pag-aaral sa mga modelong sistema ng cell ang nagpapaliwanag ng epekto ng IFN sa cellular landscape.Gayunpaman, sa kabila ng lumalagong pag-unawa sa dinamika na dulot ng mga interferon, kakaunti pa rin ang alam natin tungkol sa paglahok ng mga ISG.Kung isasaalang-alang ang pagiging kumplikado at mga dinamikong umaasa sa oras ng interferon signaling, dalawang tanong ang lumitaw: (i) posible bang patatagin at bitag ang mga multiprotein complex na kasangkot sa mabilis na pagsenyas, at (ii) maaari bang mai-mapa ang mga pakikipag-ugnayang ito sa 3D space?
Upang matugunan ang mga isyung ito, ipinatupad namin ang disuccinimide suberate-mediated chemical cross-linking (DSS) kasama ng mass spectrometry (CLMS) upang pag-aralan ang IFNα-induced protein interaction network at ang dynamics nito.Ang DSS ay nagdaragdag ng mga covalent bond sa pagitan ng mga proximal na nalalabi ng mga protina at/o mga complex ng protina sa vivo.Ang kasunod na pagsusuri ng MS ay nagpapakita ng mga partikular na crosslinking na site na nagpapakita ng spatial na kalapitan ng mga rehiyon sa loob ng isang partikular na protina, na tinatawag na internal linkages, o mga subunit sa mga complex ng protina, na tinatawag na interrelationships.Gamit ang diskarteng ito, nakilala namin ang ilang mga nobelang protina-protein complex pati na rin ang interferon-sapilitan na mga network ng pakikipag-ugnayan ng multiprotein.Sa pamamagitan ng karagdagang pagsubok sa isang subset ng mga bagong pakikipag-ugnayan na ito, ipinapakita namin na ang H2BFS (H2B histone-type na FS; pagkatapos ay tinutukoy bilang H2B) at MDN1 ay kumikilos bilang mga nagbubuklod na kasosyo para sa HLA-A.
Ang mga cell ng Flo-1 ay isa sa mga pinakakilalang in vitro na modelo ng esophageal adenocarcinoma habang ginagaya nila ang mga pangunahing tampok ng esophageal tumor22,23.Gayunpaman, hindi lahat ng mga tumor ay immunogenic, at upang matukoy kung ang mga Flo-1 na cell ay tumutugon sa interferon na paggamot, ginagamot namin ang mga Flo-1 na mga cell na may 10 ng/ml IFNα sa loob ng 72 oras.Ang mga cell ng Flo-1 ay nagpakita ng maagang induction ng pSTAT1 at IRF1, simula 2 oras pagkatapos ng paggamot at nagpapatuloy sa loob ng 72 oras, na may pagbabawas na nakasalalay sa oras sa mga nakatigil na antas ng IRF1 (Larawan 1A).Ang mga ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2, at ISG15) ay natagpuang malakas na naimpluwensyahan pagkatapos ng 6 na oras, na ginagaya ang mga klasikong mid at late phase na tugon sa IFNα (Larawan 1A).Magkasama, iminumungkahi ng mga data na ito na ang cellular model na ito ay maaaring gamitin upang pag-aralan ang mga tugon ng interferon.
Mga tugon sa pagpapahayag ng pagkakaiba-iba ng protina sa mga cell ng Flo-1 pagkatapos ng paggamot sa IFNα.(A) Ang expression ng protina sa mga cell ng Flo-1 na ginagamot ng 10 ng / ml IFNα para sa 2, 6, 24, 48 at 72 na oras ay nasuri ng immunoblot gamit ang ipinahiwatig na mga antibodies ng ISG.(B) Coomassie blue stained SDS-PAGE gels ng buong cell extract pagkatapos ng cross-linking sa DSS para sa mga ipinahiwatig na oras at konsentrasyon.(C) Sinuri ang kinatawan ng immunoblot gamit ang p53(DO-1) na antibody mula sa parehong mga sample upang masuri ang antas ng cross-linking ng protina.
Upang makuha ang in situ na tanawin ng pakikipag-ugnayan ng protina, ginamit namin ang DSS, isang malawak na ginagamit na ahente ng cross-linking dahil sa mataas na pagkamatagusin ng lamad nito at medyo maikling oras ng reaksyon.Ang mas maikling oras ng reaksyon ay nakakatulong upang maiwasan ang pagbuo ng malalaking aggregates ng mga crosslinked na protina, sa gayon ay pinapanatili ang katatagan ng crosslinker.Upang matukoy ang pinakamainam na konsentrasyon ng DSS at maiwasan ang over-crosslinking, inilantad muna namin ang mga cell sa 5, 2.5, at 1 mM DSS sa loob ng 5, 10, 5, at 30 minuto, ayon sa pagkakabanggit, at sinuri ang lysates ng Coomassie-stained SDS-PAGE (hindi ipinakita ang data) .Ang mga cell lysate ay lumilitaw na lubos na naka-cross-link sa pinakamababang konsentrasyon at sa pinakamaikling punto ng oras.Samakatuwid, ang DSS ay na-titrate sa 1, 0.5, at 0.1 mM sa loob ng 5 minuto (Larawan 1B).Ang pinakamainam na crosslinking ay sinusunod na may 0.5 mM DSS sa loob ng 5 minuto, at ang mga kundisyong ito ay pinili para sa mga cell na ginagamot sa IFNα.Bilang karagdagan, ang Figure 1C ay nagpapakita ng isang Western blot na isinagawa gamit ang p53 (DO-1) na antibody upang masuri ang antas ng cross-linking ng protina.
Ang mga cell ng Flo-1 ay ginagamot ng 10 ng/ml IFNα sa loob ng 24 na oras bago idagdag ang crosslinker.Ang mga cross-linked na cell ay kasunod na na-lysed ng dalawang-hakbang na proteolysis at ang mga protina ay naproseso ng FASP (Larawan 2)24,25.Ang cross-linked tryptic peptides ay sinuri ng mass spectrometry (Larawan 2).Ang MS/MS spectra ay itinugma sa sequence ng protina at binibilang sa MaxQuant26,27.Natukoy ang mga cross-linked na peptide mula sa nakuhang spectra gamit ang SIM-XL program, at ang mga indibidwal na compound ay pinagsama sa isang kumplikadong network gamit ang xQuest28 at SIM-XL29 open source computing software pipelines (Fig. 2).Tinutukoy ng SIM-XL ang mga interaksyon ng protina-protina, panloob na chain at indibidwal na chain sa simple o kumplikadong mga pinaghalong protina at nagbibigay ng mga script para sa pagpapakita ng mga pakikipag-ugnayan sa mga istruktura ng protina.Bilang karagdagan, niraranggo nito ang bawat cross-reference bilang isang marka ng ID ayon sa kalidad ng spectrum ng MS/MS29.Ilang lubos na maaasahang mga pakikipag-ugnayan at mga complex ng protina-protein ang natukoy, at ang isang bagong hanay ng mga pakikipag-ugnayan ay higit pang sinisiyasat gamit ang co-immunoprecipitation at mga pagbabago sa conformational ng mga complex gamit ang molecular dynamics (MD) modeling (Fig. 2) 30, 31.
Pangkalahatang-ideya ng eskematiko ng pamamaraan ng CLMS.Ang mga cell ng Flo-1 ay ginagamot ng 10 ng / ml IFNα sa loob ng 24 na oras na sinusundan ng in situ protein cross-linking gamit ang DSS na sinusundan ng cell lysis at trypsinization.Ang mga cross-linked na sample ay nasuri gamit ang isang Orbitrap mass spectrometer at karagdagang na-sample para sa fragmentation ng peptide precursors sa panahon ng LC-MS/MS.Dalawang naka-link na peptide ang natukoy mula sa nakuhang spectra gamit ang Spectrum Recognition Machine ng Crosslinked Peptides (SIM-XL) program, at ang lahat ng compound ay pinagsama sa isang kumplikadong network gamit ang computational pipelines.I-filter ang mga pakikipag-ugnayan na mababa ang kumpiyansa batay sa mga marka ng false positive rate (FDR).Maraming mga bagong high-fidelity na pakikipag-ugnayan ng protina-protina ay karagdagang nakumpirma gamit ang co-immunoprecipitation, at ang mga pagbabago sa conformational sa mga complex ay napagmasdan gamit ang molecular dynamics (MD) modeling.
Isang kabuuan ng ~30,500 at ~28,500 na mga peptide ang nakita gamit ang MaxQuant sa mga unstimulated at stimulated na mga sample ng IFNα, ayon sa pagkakabanggit (Supplement Table S1, Fig. 3A).Ang pamamahagi ng haba ng peptide sa parehong mga kaso ay nagpakita ng isang mas mataas na proporsyon ng mas malalaking peptides, na nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng mga cross-linked na peptides (Larawan 3B, C).Bilang karagdagan, ang isang mas malaking proporsyon ng mas malalaking peptides ay naroroon sa hanay ng 40-55 sa mga sample na ginagamot ng IFNα (Fig. 3C).Ang pagmamapa ng protina laban sa intensity ng log2 ay nagpakita na ang mga klasikong interferon-stimulated na protina ay ang pinaka-sagana kumpara sa mga hindi ginagamot na sample, kabilang ang MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, at HLA-F (Larawan 3D).Ang pagsusuri ng mga landas para sa mga protina na higit sa tatlong beses na pinayaman bilang tugon sa paggamot ng IFNα gamit ang database ng Reactome pathway ay nagpakita na ang pagtatanghal at pagproseso ng antigen ng MHC-I-mediated ay ang pinaka nangingibabaw na landas (Larawan 3E).Alinsunod sa mga naunang ulat, ang mga tugon ng antiviral na pinagsama ng OAS at ISG15 pati na rin ang IFNα/β at cytokine signaling ay kabilang sa mga na-activate na landas.Bilang karagdagan, ang lysine- at serine-specific na protina na cross-link ay nakilala mula sa orihinal na nakuha na MS / MS spectra gamit ang SIM-XL.Ang isang kamakailang pag-aaral ay nag-ulat ng 104 na ISG na sumasaklaw sa 20 mga virus mula sa 9 na klase ng virus sa pamamagitan ng meta-analysis ng mga indibidwal na pag-aaral ng overexpression ng ISG sa 5 uri ng cell9.Gayunpaman, upang mapagtagumpayan ang mga limitasyon sa pag-compute ng pag-screen ng malalaking dataset, nagsimula kami sa isang mas maliit na dataset upang galugarin ang mga posibleng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng listahan ng mga IRDS gen na iniulat ni Padaria et al., karamihan sa mga ito ay mga ISG.
Ang pagkakakilanlan ng mga naiibang ipinahayag na mga cross-link na protina bilang tugon sa IFNα (data na nakuha mula sa MaxQuant).(A) Venn diagram na kumakatawan sa bilang ng mga karaniwan at eksklusibong peptides na natukoy sa IFNα14 na ginagamot at hindi ginagamot na mga sample ng Flo-1.Pamamahagi ng haba ng peptide ng hindi ginagamot (B) at IFNα na ginagamot (C) na mga sample na naka-crosslink.(D) Heat map na kumakatawan sa log2 (LFQ intensity) sa pagitan ng hindi ginagamot at IFNα14 na ginagamot na Flo-1 na mga cell.Ang kaliwang panel ay nagpapakita ng mga protina na pinaka-aktibong aktibo sa pagkakaroon ng IFNα.(E) Histogram na kumakatawan sa 20 pangunahing mga landas ng pagpapayaman pagkatapos ng paggamot sa IFNα.Sinuri ng database ng Reactome pathway ang higit sa apat na beses na pagbabago sa mga upregulated na IFNα-responsive na protina.
Ang interferon-mediated ISG stimulation ay mahusay na dokumentado, ngunit sa antas ng molekular ay hindi gaanong nauunawaan kung paano nagtatapos ang mga protina na ito sa isang malawak na hanay ng mga biological function.Sinisiyasat namin ang mga pakikipag-ugnayan ng protina na may mataas na antas ng kumpiyansa sa pagitan ng mga kilalang ISG.Kapansin-pansin, nakilala namin ang isang network kasama ang MX1, USP18, ROBO1, OAS3, at STAT1 na mga protina na bumubuo ng isang malaking kumplikado bilang tugon sa paggamot ng IFNα (Larawan 4, Talahanayan S2) 32,33,34.Pinakamahalaga, ang mga pakikipag-ugnayan na ito ay natagpuan sa lahat ng mga triplicate na ginagamot sa IFNα at hindi natagpuan sa mga hindi ginagamot na sample, na nagmumungkahi na sila ay partikular na nabuo bilang tugon sa paggamot ng IFNα.Alam na ang STAT1 na transkripsyon ay kinokontrol ang pagpapahayag ng mga ISG na ito, ngunit ang pakikipag-ugnayan nito sa mga ISG sa antas ng protina ay hindi pa napag-aralan.Ang kristal na istraktura ng STAT1 ay nagpakita na ang helical domain (CCD) nito ay hindi kasangkot sa pakikipag-ugnayan sa DNA o mga protomer sa panahon ng pagbuo ng mga dimer35.Ang mga α-helice na ito ay bumubuo ng isang helical helix na istraktura na nagbibigay ng higit na hydrophilic surface area para sa mga interaksyon na mangyari 35 .Sa aming data ng CLMS, napansin namin na ang karamihan sa mga pakikipag-ugnayan sa STAT1 ay naganap sa SH2 na domain bago ang CCD, ang linker domain, o ang C-terminal tail (nalalabi 700-708) (Larawan 4A).Ang isang nakaraang pag-aaral ay nag-ulat na ang USP18 ay nagbubuklod sa CCD at DNA-binding domain (DBD) ng STAT2 at na-recruit sa subunit ng type I interferon receptor IFNAR2 upang mamagitan ang pagsugpo sa type I interferon signaling 24 .Ipinakita din ng aming data na ang USP18 catalytic domain ay nakikipag-ugnay sa STAT1 DBD (Larawan 4A, D), na nagmumungkahi na ang parehong STAT1 at STAT2 ay maaaring gumanap ng isang papel sa pag-akit ng USP18 sa IFNAR2.
Protein-protein ISG network na kinilala sa mga cross-linked na cell na ginagamot sa IFNα.(A) plot ng pakikipag-ugnayan ng 2D na nagpapakita ng mga pakikipag-ugnayan ng protina-protein (nabuo sa programa ng SIM-XL), na may mga linya na kumakatawan sa mga intermolecular na pakikipag-ugnayan (nakatakda ang crosslink cutoff sa 3.5).Ang mga domain ng iba't ibang pagkakakilanlan ay minarkahan ng kanilang kulay32: MX1 domain, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), at GED (569–660).Mga domain ng OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), at OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) at fn3 (777–864).Mga field ng STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), at STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Circular viewer ng mga cross-linked na protina (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, at STAT1) na may mga pakikipag-ugnayan at pakikipag-ugnayan na may label na asul at pula, ayon sa pagkakabanggit.Ang cross-link na threshold ay itinakda sa 3.5.Ang mga plot ng tuldok ay nagpapahiwatig ng mga site ng pakikipag-ugnayan ng STAT1 na may MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), at OAS3 (F), pati na rin ang mga site ng pakikipag-ugnayan ng K o S sa pagitan ng dalawang peptide.Sa figure, ang threshold ng cross-link na marka ay nakatakda sa 3.0.(G) Iba't ibang mga site ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng STAT1 at OAS3 DI na mga domain na nakapatong sa kanilang mga istruktura ng protina sa PyMol (PyMOL molecular graphics system, bersyon 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) at OAS3 (pdb id: 4s3n34).) programa.
Dalawang isoform ng USP18 ang inilarawan sa mga tao, isang full-length na protina na higit na matatagpuan sa nucleus, at isang isoform na walang N-terminal domain, USP18-sf, na pantay na ipinamamahagi sa cytoplasm at nucleus 36 .Bilang karagdagan, ang N-terminus ay hinulaang hindi nakaayos at hindi nangangailangan ng aktibidad ng isopeptidase o ISG1537 na nagbubuklod.Karamihan sa mga pakikipag-ugnayan na natukoy sa aming pag-aaral ay matatagpuan sa N-terminus ng protina, na nagmumungkahi na ang mga pakikipag-ugnayan na ito ay nagsasangkot ng buong haba na USP18 (Larawan 4A, D) at sa gayon ay malamang na mangyari sa nucleus.Bukod dito, ipinapahiwatig din ng aming data na ang N-terminus ay dalubhasa para sa mga pakikipag-ugnayan ng protina-sa-protina.Ang IFNAR2 binding site ay matatagpuan sa pagitan ng mga nalalabi 312-368, at kapansin-pansin, wala sa mga protina sa kumplikadong nagbubuklod sa rehiyong ito (Larawan 4A) 37,38 .Ang mga data na ito na pinagsama-sama ay nagpapahiwatig na ang IFNAR2 binding domain ay eksklusibong ginagamit ng receptor protein.Bilang karagdagan, ang OAS3 at ROBO1 lamang ang natagpuang nauugnay sa mga domain sa agos ng N-terminus at IFNAR2 binding site (Larawan 4A).
Ang ROBO1 ay kabilang sa immunoglobulin (Ig) superfamily ng transmembrane signaling molecules at binubuo ng limang Ig domain at tatlong fibronectin (Fn) na domain sa extracellular region.Ang mga extracellular domain na ito ay sinusundan ng isang lamad-proximal na rehiyon at isang solong transmembrane helix 39. Ang isang hindi nakaayos na intracellular na rehiyon ay matatagpuan sa C-terminus at naglalaman ng mga conserved sequence motif na namamagitan sa effector protein binding39.Ang rehiyon na umaabot mula sa mga amino acid ~1100 hanggang 1600 ay kadalasang hindi maayos.Nalaman namin na ang MX1 ay nakikipag-ugnayan sa ROBO1 sa pamamagitan ng Ig, Fn, at intracellular na mga domain, habang ang karamihan sa mga pakikipag-ugnayan sa STAT1 ay nangyayari sa pagitan ng kanyang CCD, linker domain, at ang C-terminus ng ROBO1 (Fig. 4A, E).Sa kabilang banda, ang mga pakikipag-ugnayan sa mga rehiyon ng linker ng DI, DIII, at OAS3 ay ipinamahagi sa buong protina ng ROBO1 (Larawan 4A).
Ang pamilya ng protina ng oligoadenylate synthase (OAS) ay tumatanggap at nagbubuklod sa intracellular double-stranded na RNA (dsRNA), sumasailalim sa mga pagbabago sa conformational, at nagsi-synthesize ng 2′,5′-linked oligoadenylates (2-5 As) 40 .Napag-alaman na sa tatlong OAS, ang OAS3 ay nagpapakita ng pinakamataas na affinity para sa dsRNA at nag-synthesize ng hindi bababa sa halaga ng 2-5 As, na maaaring mag-activate ng RNase L at sa gayon ay nililimitahan ang viral replication 41 .Ang pamilya ng OAS ay binubuo ng polymerase beta (pol-β)-like nucleotide transferase domains.Ipinakita ng nakaraang pananaliksik na ang aktibidad ng catalytic ng C-terminal domain (DIII) ay nakasalalay sa dsRNA-binding domain (DI), na kinakailangan para sa pag-activate ng OAS342.Napansin namin na ang DI at DII na mga domain ng OAS3 ay nakikipag-ugnay sa CCD at isang maliit na rehiyon ng junction sa pagitan ng SH2 at STAT1 TAD (Larawan 4A, F).Ang pag-overlay ng iba't ibang mga crosslinking site sa istruktura ng protina ay nagsiwalat ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng β-sheet at DBD STAT1 loop at isang bukas na bulsa o lukab na nabuo ng mga nalalabi 60–75 sa DI domain ng OAS3 (Fig. 4G).Ang oryentasyon ng mga protina sa complex ay nagpahiwatig din na wala sa mga pakikipag-ugnayan sa OAS3 ang nakakasagabal sa kakayahan ng DNA-binding ng DI domain nito (Fig. S1A).Bilang karagdagan, ang N-terminal na domain ng GTPase MX1 ay malawakang nakikipag-ugnayan sa DI at DIII na mga domain ng OAS3 (Larawan 4A).Napansin din namin ang isang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng OAS1 at MX1 sa lahat ng tatlong pag-uulit na ginagamot ng IFNα, kung saan ang isang domain ng OAS1 (aktibo din sa catalytically) ay nakipag-ugnay sa lahat ng tatlong mga domain ng MX1 (Larawan S2A, B).
Ang mga MX protein ay bahagi ng isang malaking pamilya ng dynein-like GTPases na naglalaman ng N-terminal GTPase domain na nagbubuklod at nag-hydrolyze sa GTP, isang intermediate domain na namamagitan sa self-assembly, at isang C-terminal leucine zipper na nagsisilbing GTPase (LZ). ).domain effector domain25,43.Ang MX1 ay nagbubuklod sa mga subunit ng viral polymerases upang harangan ang transkripsyon ng viral gene43.Ang naunang naiulat na yeast two-hybrid screen ay nagpakita na ang PIAS1-associated MX1 ay humahadlang sa STAT1-mediated gene activation sa pamamagitan ng pagharang sa DNA-binding activity at mayroon ding SUMO E344,45 ligase activity.Dito, ipinapakita namin na ang MX1 ay nagbubuklod sa STAT1 (Larawan 4C, D), gayunpaman kung paano nakakaapekto ang pakikipag-ugnay na ito sa STAT1-mediated gene activation bilang tugon sa IFNα ay nangangailangan ng karagdagang pag-aaral.Bilang karagdagan, nalaman din namin na ang MX1 ay nakipag-ugnayan sa IFIT3 at DDX60 sa lahat ng tatlong pag-uulit na ginagamot ng IFNα (Fig. S2C).
Ang DDX60 ay isang IFN-induced cytoplasmic helicase na dati nang naiulat na gumaganap ng isang papel sa RIG-I-independent degradation ng viral RNA46.Nakikipag-ugnayan ito sa RIG-I at ina-activate ang pagsenyas nito sa paraang partikular sa ligand 46. Ang DDX60 ay binubuo ng isang DEXD/H-Box helicase domain at isang C-terminal helicase domain na nagbubuklod sa viral RNA at DNA47.Karamihan sa mga pakikipag-ugnayan nito sa MX1 at IFIT3 ay nangyayari sa loob ng mahabang rehiyon ng N- at C-terminal na walang mga canonical na domain o motif (Fig. S2E, F).Gayunpaman, ang MX1 ay nauugnay din sa DEXD/H-Box helicase domain (Fig. S2E).Ang mga protina ng pamilya ng IFIT ay may magkasabay na mga kopya ng isang natatanging helix-turn-helix motif na tinatawag na tetrapeptide repeat (TPR).Ang IFIT3 ay natagpuan na isang positibong modulator ng RIG-I signaling at samakatuwid ay isang bahagi ng MAVS complex.Kung sama-sama, iminumungkahi ng aming data na ang IFIT3 at DDX60 ay pangunahing nakikipag-ugnayan sa rehiyon sa pagitan ng TPR 3–6 ng IFIT3 at maaaring gumanap ng isang papel sa RIG-I/MAVS signaling (Fig. S2F).
Dahil ang screening sa buong proteome ay computationally intensive, pagkatapos ay na-screen namin ang buong database ng UniProt ng tao para sa pagkakaroon ng isa sa IFNα-treated repeats.Sa replica na ito, nakakita kami ng ilang lubos na maaasahang mga network ng pakikipag-ugnayan para sa HLA-A.Ang pagsusuri sa mga daanan ng protina na kinilala ng MS/MS spectra ay nagpakita na ang MHC-I-based na pagpoproseso at pagtatanghal ng antigen ay ang pangunahing landas na dulot ng interferon (Fig. 3D).Samakatuwid, nakatuon kami sa pag-aaral ng mga pakikipag-ugnayan ng protina ng mga molekula ng MHC-I na may mataas na antas ng kumpiyansa sa lahat ng mga cross-link na sample.Ang HLA ay binubuo ng α1, α2 at α3 na mga domain at light chain, at ang microglobulin β2 (β2m) ay isang pare-parehong chaperone protein49.Kapag natipon sa endoplasmic reticulum, ang HLA ay hindi matatag sa kawalan ng peptide ligands50.Ang peptide-binding groove ay nabuo ng highly polymorphic at unstructured na α1 at α2 na mga domain sa non-peptide form at ang medyo hindi gaanong polymorphic na α351 na domain.Sa pagkakaroon ng IFNα, nakita namin ang dalawang HLA-A complex: ang isa ay nakikipag-ugnay sa HMGA1 at H2B (Larawan 5, Talahanayan S3) at ang iba ay nakikipag-ugnay sa MDN1, LRCH4 at H2B (Larawan 6).
Ang IFNα ay nag-uudyok ng isang HLA-A na network ng pakikipag-ugnayan sa H2B (H2BFS) at HMGA1.(A) 2D plot (binuo sa SIM-XL software) na naglalarawan ng iba't ibang uri ng mga pakikipag-ugnayan sa H2B-HLA-A-HMGA1 complex: interlink (asul), interlink (pula) at solong link (itim)..Ang mga domain ng iba't ibang pagkakakilanlan ay color coded32: H2B (histone; 2–102) at MHC-I (MHC_1; 25–203, pangkat C1; 210–290 at MHC_I_C; 337–364).Ang cross-link na threshold ay itinakda sa 3.5.Ang mga tuldok na plot ay nagpapahiwatig ng mga site ng pakikipag-ugnayan ng HLA-A na may H2B (B) at HMGA1 (C), pati na rin ang mga site ng pakikipag-ugnayan ng K o S sa pagitan ng dalawang peptide.Sa figure, ang threshold ng cross-link na marka ay nakatakda sa 3.0.(D) Mga ugnayan sa pagitan ng mga protina na ipinapakita sa mga istruktura ng mga protina ng H2B, HLA-A, at HMGA1 sa programang PyMOL.Ang mga istrukturang ito ay na-modelo gamit ang Phyre2 server (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) at ang mga istruktura ng template para sa mga protina ng H2B, HLA-A at HMGA1 ay 1kx552, 1kj349 at 2eze55, ayon sa pagkakabanggit.
Ang IFNα ay nag-uudyok ng isang HLA-A na network ng pakikipag-ugnayan sa H2B (H2BFS), MDN1 at LRCH4.(A) Intramolecular (pula) at intermolecular (asul) na mga crosslink na ipinakita sa isang 2D interactive na mapa (binuo sa SIM-XL software) na may MDN1 na kinakatawan bilang isang bilog.Ang cross-link na threshold ay itinakda sa 3.5.Ang mga domain ng iba't ibang pagkakakilanlan ay color coded32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, pangkat C1; 210–290 at MHC_I_C; 337–364) at LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) at CH (535–641)).(B) Mga ugnayan sa pagitan ng mga protina na ipinapakita sa mga istruktura ng mga protina ng H2B, HLA-A, LRCH4, at MDN1 sa programang PyMOL.Ang mga istrukturang ito ay na-modelo gamit ang Phyre2 server (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) na may mga istrukturang template na 1kx552, 1kj349, 6hlu62 at 6i2665 para sa mga protina ng H2B, HLA-A, LRCH4 at MDN1, ayon sa pagkakabanggit.Mga tuldok na plot na nagpapakita ng mga site ng pakikipag-ugnayan ng K o S para sa HLA-A na may H2B (C), LRCH4 (D), at MDN1 (E).Para sa mga plot, itinakda sa 3.0 ang cross-link score threshold.
Bilang karagdagan sa pagpapanatili ng integridad ng genome, ang histone H2B ay kasangkot din sa regulasyon ng transkripsyon.Ang protina ng H2B ay binubuo ng isang central histone domain (HFD) na nabuo ng tatlong α-helice na pinaghihiwalay ng mga loop at isang C-terminal tail 41,52.Karamihan sa pakikipag-ugnayan sa H2B ay nangyayari sa α1 helix, na nagbibigay ng trimerization sa HFD heterodimer (Larawan 5A, B).Bagaman ang mga lysin ay kasangkot sa pagbubuklod ng DNA, ang ilang mga lysin ay mga alternatibong acetylation o methylation site din.Halimbawa, ang mga nalalabi na K43, K46, at K57 mula sa H2B ay hindi kasangkot sa direktang pagbubuklod ng DNA, ngunit mga target ng iba't ibang post-transcriptional na mga pagbabago53.Katulad nito, ang mga nalalabi na K44, K47, at K57 sa H2B ay maaaring gumanap ng isang alternatibong papel sa pagkakaroon ng IFNα, kabilang ang mga pakikipag-ugnayan sa iba pang mga protina (Larawan 5A, B).Bilang karagdagan, ang extrachromosomal histone na H2B ay nagpapagana ng immune response sa iba't ibang uri ng cell, na kumikilos bilang isang cytosolic sensor upang makita ang mga double-stranded na DNA (dsDNA) na mga fragment na nagmula sa mga nakakahawang ahente o nasira na mga cell54.Sa pagkakaroon ng mga virus ng DNA, ang pag-ubos ng H2B ay humadlang sa produksyon ng IFN-β at STAT154 phosphorylation.Ang H2B ay kilala rin na lumipat sa loob at labas ng nucleus nang mas mabilis kaysa sa iba pang mga core histone54.Ang mga pakikipag-ugnayan ng H2B sa MDN1 at LRCH4 ay naobserbahan din sa mga napiling hindi ginagamot na mga sample.Natagpuan namin na ang HLA-A ay nakipag-ugnay sa H2B sa lahat ng tatlong mga sample na ginagamot ng IFNα at sa isang hindi ginagamot na paulit-ulit na sample.Ang mga datos na ito ay sumasalamin sa papel ng H2B sa isang alternatibong physiological function na independiyente sa transkripsyon na regulasyon.
Ang HMGA1 (high mobility group AT-Hook 1), isang maliit na nucleoprotein na mayaman sa mga amino acid na nagpo-promote ng sakit, ay nakilala na kasama ng HLA-A.Mayroon itong acidic na C-terminal tail at tatlong natatanging DBD na tinatawag na AT hooks dahil sila ay nagbubuklod sa minor groove ng AT-rich region sa dsDNA55,56.Ang pagbubuklod na ito ay nagiging sanhi ng pagyuko o pagtuwid ng DNA, na nagbibigay-daan sa canonical transcription factor na ma-access ang consensus sequence nito.Ang buntot ng C-terminal ay pinaniniwalaan na kasangkot sa mga pakikipag-ugnayan ng protina-protina at ang pangangalap ng mga salik ng transkripsyon, dahil ang mga C-terminal deletion mutants ay hindi makapagpasimula ng transkripsyon57.Bukod dito, ang domain na ito ay naglalaman ng ilang mga conserved phosphorylation site na kilalang mga substrate para sa kinases 58 .Naobserbahan namin ang mga pakikipag-ugnayan ng HLA-A at H2B sa HMGA1 sa labas ng C-terminal domain, na nagmumungkahi na ang C-terminal domain ay pangunahing ginagamit para sa transcription factor binding (Fig. 5A, C).Ang mga protina ng HMGA ay nakikipagkumpitensya sa histone H1 para sa pagbubuklod sa adaptor ng DNA, sa gayon ay nadaragdagan ang pagiging naa-access57.Katulad nito, tila malamang na nakikipag-ugnayan ang HMGA sa histone H2B kasama ang linker DNA sa kumpetisyon sa histone H1.Ang HMGB1 ay nagpapahiwatig ng pagpapahayag ng HLA-A, -B, at -C sa mga dendritic na selula, na humahantong sa kanilang pag-activate59, ngunit ang isang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng HMG at HLA ay hindi pa naiulat na dati.Natagpuan namin na ang HMGA1 ay nakikipag-ugnay sa α1 at α3 na mga domain ng HLA-A, kasama ang karamihan sa mga pakikipag-ugnayan sa labas ng 3 DBD nito (Larawan 5A, C).Sa aming mga kamay, ang HLA-A ay natagpuan na naisalokal sa nucleus (hindi ipinakita ang data), at ibinigay na ang H2B at HMGA1 ay naroroon din sa nucleus, malamang na nangyayari ang pakikipag-ugnayan na ito sa nucleus.Ang mga partikular na adduct na sinusukat sa pagitan ng H2B, HLA-A, at HMGA1 ay ipinapakita sa Figure 5D.
Karamihan sa mga pakikipag-ugnayan ng HLA-A sa iba pang mga protina ay nangyayari sa loob ng α1 at α2 na mga domain nito at ang hindi maayos na C-terminal na domain (Larawan 6).Sa isa sa mga halimbawang ito, nalaman namin na ang HLA-A ay nakikipag-ugnay sa hindi maayos na N-terminal tail ng LRCH4 (Larawan 6A, D).Kinokontrol ng LRCH4 ang pag-activate ng TLR4 at induction ng LPS cytokine, sa gayon ay binabago ang likas na tugon ng immune60, 61.Ito ay isang membrane protein na may siyam na leucine-rich repeats (LRRs) at isang calmodulin (CH) homology motif sa ectodomain nito, na sinusundan ng isang transmembrane domain (TMD) 60 , 62 .Ang mga domain ng CH ay naiulat na namamagitan sa mga pakikipag-ugnayan ng protina-protina 60 .Ang isang kahabaan ng humigit-kumulang 300 amino acid sa pagitan ng mga domain ng LRR at CH ay medyo naa-access ngunit hindi maayos.Batay sa pag-andar ng mga hindi maayos na rehiyon bilang mga tagapamagitan ng mga network ng protina-protina at vesicular transport 63, nalaman namin na ang karamihan sa mga pakikipag-ugnayan ng protina ay nangyayari sa mga hindi maayos na rehiyon.Ang mga pakikipag-ugnayan sa MDN1 ay ipinamahagi sa buong haba ng protina, kabilang ang LRR1, LRR6, CH domain, at random na mga rehiyon, habang ang H2B ay pangunahing nakagapos sa CH domain (Larawan 6A, B).Kapansin-pansin, wala sa mga pakikipag-ugnayan ang kasama ang TMJ, na nagmumungkahi ng pagiging tiyak ng diskarte sa CLMS (Larawan 6A, B).
Ang MDN1 ay nakilala rin bilang bahagi ng network ng protina ng HLA-A (Larawan 6A).Ito ay kabilang sa pamilya ng AAA ng mga protina (ATPases na nauugnay sa iba't ibang aktibidad).Ito ang parehong N-terminal AAA domain na nag-aayos sa isang hexameric ring at nag-aalis ng assembly factor mula sa 60S 64 ribosomal subunit.mukhang katulad ng dynein64,65,66.Sa karagdagan, ang Asp/Glu rich region ay sinusundan ng MIDAS domain (metal ion dependent site).Dahil sa malaking sukat ng MDN1 (humigit-kumulang 5600 amino acid) at ang limitadong homology nito na may mahusay na pinag-aralan na mga protina, kakaunti ang nalalaman tungkol sa istraktura at paggana nito sa mga tao.Nakilala namin ang HLA-A, H2B, at LRCH4 bilang mga kasosyo na nagbubuklod ng MDN1 at inihayag ang kanilang oryentasyon bilang mga kumplikadong protina sa PyMol (Larawan 6A, B).Ang tatlong protinang ito ay nakikipag-ugnayan sa AAA domain, ang dynein-like linker domain, at posibleng MIDAS MDN1 domain.Sa isang nakaraang ulat, ang affinity purification ng mga bait protein ay nakilala ang MDN1 bilang isang protina na nauugnay sa histone H2B67.Bilang karagdagan, ang isang kamakailang pag-aaral ay nag-ulat din ng isang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng MDN at HLA-B sa mga cell ng HCT116 gamit ang affinity-purified mass spectrometry, na sumusuporta sa aming mga natuklasan68.Ang pagkakakilanlan ng kumplikadong ito sa mga sample na ginagamot ng IFNα ay nagmumungkahi ng isang papel para sa MDN1 sa interferon signaling.
Dahil mataas ang polymorphic ng mga HLA genes, kinuha namin ang mga sequencing read na pagmamapa ng HLA-A, -B, at -C mula sa RNA sequencing data ng Flo-1 cells (hindi ipinakita ang data).Ang mga pagkakasunud-sunod ng peptide na naaayon sa pagbabasa ng pagkakasunud-sunod ay nagsiwalat ng mga makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng HLA-A, -B, at -C sa mga rehiyon kung saan matatagpuan ang mga cross-link na peptides sa HLA-A (Larawan S3).Bilang karagdagan, hindi namin napansin ang cross-linking ng protina-sa-protein ng mga molekulang HLA-B/C na may mga protina ng H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Iminumungkahi nito na ang pakikipag-ugnayan ng protina na natagpuan sa pagitan ng HLA-A, MDN1, LRCH1 at HMGA1 ay tiyak sa HLA-A.Bilang karagdagan, ang pagsusuri ng proteomic ng mga hindi naka-crosslink na sample (Talahanayan S4) ay nagpakita na ang HLA-A ay may mas mataas na pagkakasunud-sunod na saklaw kumpara sa HLA-B o HLA-C.Ang mga peptide na natukoy para sa HLA-A ay mataas sa intensity sa parehong IFNα-treated at untreated sample.
Upang matiyak na ang mga pakikipag-ugnayan na natukoy dito ay hindi dahil sa hindi tiyak na cross-linking ng dalawang protina sa malapit na spatial na kalapitan, lalo naming nakumpirma ang dalawang bagong HLA-A na nakikipag-ugnay na mga kadahilanan sa pamamagitan ng pagsasagawa ng co-immunoprecipitation assays.Ang mga pakikipag-ugnayan ng HLA-A sa endogenous MDN1 at H2B ay nakita sa parehong IFNα-treated at untreated Flo-1 cells (Larawan 7, Larawan S4).Kinumpirma namin na ang HLA-A ay nakuha ng H2B sa mga immunoprecipitates at ang asosasyong ito ay dahil sa paggamot ng IFNα dahil wala ang HLA-A sa mga immunoprecipitate na sample mula sa mga hindi ginagamot na mga cell (Larawan 7A).Gayunpaman, iminumungkahi ng aming data na ang IFNα ay naiibang kinokontrol ang HLA-A na nagbubuklod sa H2B at MDN1.Ang IFNα ay nagpapahiwatig ng kaugnayan sa pagitan ng H2B at HLA-A, ngunit binabawasan ang kaugnayan nito sa MDN1.Natagpuan namin na ang MDN1 ay nauugnay sa HLA-A sa mga kontrol, at ang pagdaragdag ng IFNα ay nabawasan ang pakikipag-ugnay na ito na independiyenteng ng MDN1 induction ng IFNα (Larawan 7B, C).Bilang karagdagan, nakuha ng immunoprecipitation ng HLA-A ang H2B sa mga cell ng A549 (Fig. S4), na nagmumungkahi na ang pakikipag-ugnayan na ito ay independiyente sa uri ng cell.Kung sama-sama, sinusuportahan ng mga resultang ito ang interferon-mediated na pakikipag-ugnayan ng HLA-A sa H2B at MDN1.
Pinagsasama-sama ng HLA-A ang H2B at MDN1.Ang kinatawan ng endogenous H2B (A) at MDN1 (B) immunoblots ay immunoprecipitated mula sa IFNα-treated Flo-1 cells at sinisiyasat para sa ipinahiwatig na mga antibodies.Ang mouse at rabbit IgG ay ginamit bilang isang negatibong kontrol.(C) Ang mga kamag-anak na halaga (input) ng iba't ibang antigens ay inilalarawan ng mga immunoblots na sinuri laban sa ipinahiwatig na mga antibodies, ginamit ang β-actin bilang kontrol sa pag-load.
Ang mga istrukturang katangian ng isa sa interferon-induced highly reliable cross-linked network, H2B-HLA-A-HMGA1, ay sinisiyasat.Ginamit namin ang pagmomodelo ng molekular na dinamika bilang isang alternatibong diskarte upang maunawaan ang conformational dynamics ng mga protina na kasangkot sa kumplikadong ito (Larawan 8).Ang mga hinuha mula sa data ng CLMS ay nagmumungkahi ng posibilidad ng iba't ibang mga pagsasaayos ng mga protina ng H2B, HLA-A, at HMGA1.Samakatuwid, ang mga sumusunod na potensyal na complex ay namodelo sa isang solvent medium: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, at H2B-HLA-A-HMGA1.Ang isang paunang protina-protein docking screen gamit ang MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) na pakete ay nagmungkahi ng mga posibleng conformation na naiiba sa pagitan ng mga protina na ito (Fig. 8A).Ang visualization ng docking protein complex ay nagsiwalat ng ilang mga pakikipag-ugnayan at posibleng mga conformation (Larawan 5A, 8).Kaya, ang isang posibleng conformation ay ipinapakita sa Figure 8A (na may label na mga cross-link) at ito ay karagdagang nasuri gamit ang MD modeling pipeline.Bilang karagdagan, ang pagbubuklod ng H2B o HMGA1 sa HLA-A ay nagtatampok sa mas mataas na pagkakaugnay ng H2B para sa HLA-A (Larawan 8A).
Conformational dynamics ng mga posibleng network sa pagitan ng H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, at H2B-HLA-A-HMGA1 complex.(A) Ang kaliwang panel ay isang 2D na mapa (binuo sa SIM-XL software) ng intramolecular (pula) at intermolecular (asul) na mga crosslink (crosslink cutoff na nakatakda sa 3.5).Bilang karagdagan, ang mga cross-linking residues na natukoy ay may label sa mga istruktura ng H2B, HLA-A, at HMGA1 na protina.Ang mga nauugnay na conformation ng mga protina na ito ay nakuha gamit ang docking pipeline na ipinatupad sa MOE package.Ang ibabang kaliwang panel ay nagpapakita ng iba't ibang posibleng conformation ng H2B-HLA-A at HMGA1-HLA-A complex na may iba't ibang mga protein-protein binding affinities (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Standard deviation (RMSD) ng mga atomic na posisyon (hindi kasama ang hydrogen atoms) para sa bawat istruktura ng protina.(C) Intermolecular protein-protein hydrogen bond na mga pakikipag-ugnayan mula sa iba't ibang simulate complex na isinasaalang-alang ang mga tiyak na pakikipag-ugnayan ng tagal ≥ 10 ns.Ang h-bond donor-acceptor cutoff distance ay itinakda sa 3.5 Å, at ang donor-H-acceptor cutoff angle ay itinakda sa ≥ 160°–180°.(D) Mga nalalabi na may label na bumubuo ng mga pakikipag-ugnayan ng protina-protein ng HLA-A sa kani-kanilang mga kasosyo, na sumasaklaw sa ≥ 20 ns, na nakuha mula sa dummy HLA-A-H2B at HLA-A-HMGA1 complex.Ang mga istruktura ng protina ay kumakatawan sa isang average na istraktura ng 100 ns MDS.(E) Mga pakikipag-ugnayan sa pagitan ng HLA-A-H2B at HLA-A-HMGA1 complex kumpara sa mga pakikipag-ugnayan na sinusubaybayan ng H2B-HLA simulation na higit sa 100 ns batay sa site ng pakikipag-ugnayan ng K o S sa pagitan ng dalawang peptides.Mga Complex /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Ang halaga ng threshold para sa pagsusuri ng mga cross-link ay itinakda sa 3.0, at ang mga partikular na pakikipag-ugnayan mula sa MDS na kumukuha ng ≥ 10 ns ay isinasaalang-alang.Na-visualize ang mga istruktura ng protina gamit ang BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) at Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) na mga pakete.
Ang katatagan ng mga molekula ng HLA-A sa paglipas ng panahon (standard deviation; RMSD o standard deviation; RMSF) ay nagpahiwatig na ang pagkakaroon ng H2B o HMGA1 na mga protina sa mga complex ay nagpapatatag ng HLA-A (Larawan 8B, Larawan S5).Ang protina ng HMGA1 ay mahigpit na nagbubuklod sa B2M site ng HLA-A, na hinihimok ang katatagan ng HLA-A amino acid sa HLA-A-HMGA1 o H2B-HLA-A-HMGA1 complex (Larawan 8B, Larawan S5).sa partikular, ang mga nalalabi ng HLA ~60-90 at ~180-210 ay nakitang hindi gaanong nababaluktot sa pagkakaroon ng H2B (FIG. 8B).Ang H2B at HMGA1 ay nagpakita ng mas mahusay na pagbubuklod sa HLA-A sa H2B-HLA-A-HMGA1 complex kumpara sa HLA-A na nagbubuklod sa H2B o HMGA1 lamang (Larawan 8C, D; Talahanayan S5).Ang mga nalalabi na kasangkot sa hydrogen bonding (MD modeled high occupancy ≥ 10 ns) ay nag-tutugma sa mga site ng pakikipag-ugnayan ng CLMS (K o S residues) sa complex, na nagmumungkahi na ang mga pakikipag-ugnayan na kinilala ng CLMS ay napaka maaasahan.Pagiging maaasahan (Larawan 8E).Sa pagmomodelo ng CLMS at MD, ang mga nalalabi ng HLA-A sa pagitan ng humigit-kumulang 190-210 at humigit-kumulang 200-220 amino acid ay natagpuang nagbubuklod sa H2B at HMGA1, ayon sa pagkakabanggit (FIG. 8E).
Ang mga interaksyon ng protina-protina ay bumubuo ng mga dynamic na istrukturang network na namamagitan sa intracellular na komunikasyon bilang tugon sa ilang partikular na stimuli.Dahil maraming mga diskarte sa proteomics ang nakakakita ng mga pagbabago sa pangkalahatang steady na antas ng estado ng isang protina, ang dynamics ng interaksyon ng protina-protein ay nangangailangan ng mga karagdagang tool upang makuha ang mga nagbubuklod na interface, at ang CLMS ay isa sa gayong tool.Ang interferon signaling system ay isang cytokine network na nagpapahintulot sa mga cell na tumugon sa isang hanay ng environmental pathogenic at intrinsic pathological signal, na nagtatapos sa induction ng mga subset ng interferon-inducible na mga protina.Inilapat namin ang CLMS upang matukoy kung ang mga nobelang pakikipag-ugnayan ng protina-protina ay maaaring makilala sa isang panel ng mga interferon-sapilitan na protina.Ang pandaigdigang pagsusuri sa cross-linking ng protina sa isang interferon-responsive na Flo-1 na modelo ng cell ay ginamit upang makuha ang mga kumplikadong protina.Ang pagkuha ng mga tryptic peptides mula sa mga non-cross-linked at cross-linked na mga cell ay nagbibigay-daan para sa pagbibilang ng peptide, pagpapayaman ng pathway, at pamamahagi ng haba ng peptide na may tinukoy na intensity ng LFQ.Ang mga canonical interferon-inducible na protina ay nakilala bilang isang positibong panloob na kontrol, habang ang mga bagong intermolecular at intramolecular na cross-linked na mga adduct ng canonical interferon-inducible na mga protina tulad ng MX1, UP18, OAS3 at STAT1 ay naobserbahan.Ang iba't ibang mga tampok sa istruktura at pakikipag-ugnayan sa mga functional na lugar ay sinisiyasat.
Ang isang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng HLA-A, MDN1 at H2B ay nakita sa pamamagitan ng immunoblotting sa Flo-1 at A549 na mga cell na ginagamot at hindi ginagamot sa IFNα.Itinatampok ng aming mga resulta na ang HLA-A complex ay may H2B sa paraang umaasa sa IFNα.Ang aming trabaho ay kumakatawan sa isang kawili-wiling paraan para sa karagdagang paggalugad ng co-localization ng dalawang complex na ito.Magiging interesante din na palawakin ang diskarte ng CLMS sa isang panel ng mga linya ng cell upang makilala ang mga interferon-mediated na interaksyon ng protina ng cell-type-independent.Sa wakas, ginamit namin ang pagmomodelo ng MD bilang isang alternatibong diskarte upang maunawaan ang conformational dynamics ng mga protina na kasangkot sa H2BFS-HLA-A-HMGA1 complex, na sinusubaybayan ang intramolecular at intermolecular cross-talks.Ang mga hinuha mula sa data ng CLMS ay nagmumungkahi ng posibilidad ng iba't ibang mga pagsasaayos ng mga protina ng H2BFS, HLA-A, at HMGA1.Ang posibleng iba't ibang mga conformation sa pagitan ng mga docking protein complex na ito ay nagsiwalat ng ilang mga pakikipag-ugnayan na katulad ng mga naobserbahan sa dataset ng CLMS.Ang isa sa mga pangunahing lakas ng aming pamamaraan ay pinapayagan nito ang madaling pagkakakilanlan ng mga nakikipag-ugnay na mataas na polymorphic na mga gene tulad ng HLA, kaya magiging kawili-wiling pag-aralan ang mga pakikipag-ugnayan ng mga protina na partikular sa HLA na haplotype na kung hindi man ay mahirap pag-aralan.Kung pinagsama-sama, ipinapakita ng aming data na maaaring gamitin ang CLMS upang palawakin ang aming pang-unawa sa mga network ng senyas na dulot ng interferon at magbigay ng batayan para sa pag-aaral ng mas kumplikadong mga intercellular system sa tumor microenvironment.
Ang mga cell ng Flo-1 ay nakuha mula sa ATCC at pinananatili sa DMEM (Gibco) na pupunan ng 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen), 10% fetal bovine serum (Gibco) at nakaimbak sa 37°C at 5% CO2.Incubation.Ang mga cell ay lumaki sa 70-80% na kumpol bago ginagamot sa IFNα14 (ginawa ng Edinburgh Protein Production Facility).Ang lahat ng iba pang mga kemikal at reagents ay binili mula sa Sigma Aldrich maliban kung nabanggit.
Ang mga cell ng Flo-1 ay na-culture sa 6-well plate at sa susunod na araw ang mga cell ay ginagamot ng 10 ng/ml IFNα14 sa loob ng 24 na oras hanggang sa humigit-kumulang 80% na kumpol.Ang mga cell ay hinugasan ng tatlong beses gamit ang PBS at pinagtalian ng sariwang inihanda na DSS (Thermo Fisher Scientific) (natunaw sa DMSO) sa PBS sa loob ng 5 min sa 37° C. hanggang sa huling konsentrasyon na 0.5 mM.Ang reaksyon ng crosslinking ng DSS ay pinalitan ng PBS at ang natitirang DSS ay napatay sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 20 mM Tris (pH 8.0) sa PBS sa loob ng 15 min sa 37 ° C.Ang mga cell ay nakolekta sa pamamagitan ng pag-scrape at nakolekta sa mga low binding tubes (Axygen).
Ang cell pellet ay na-lysed na may 300 µl ng urea lysis buffer (8 M urea, 0.1 M Tris, pH 8.5) sa loob ng 30 min sa temperatura ng silid na may paminsan-minsang pagyanig.Ang lahat ng mga hakbang sa centrifugation ay isinagawa sa 14,000 xg sa 8 ° C.I-centrifuge ang lysate sa loob ng 10 minuto at ilipat ang supernatant sa isang bagong tubo.Ang natitirang malinaw na mga particle ay natunaw sa 150 μl ng pangalawang lysis buffer (2 M urea, 2% (w/v) SDS (sodium dodecyl sulfate)) sa loob ng 30 minuto o higit pa hanggang sa makuha ang isang homogenous aqueous solution.Ang lysate ay nakasentro sa loob ng 20 minuto at ang supernatant ay hinalo sa lysate na nakuha sa nakaraang hakbang.Ang mga konsentrasyon ng protina ay tinasa gamit ang Micro BCA assay (Thermo Fisher Scientific) ayon sa mga tagubilin ng tagagawa para sa mga pamamaraan ng microplate.Ang mga sample ay mabilis na nagyelo sa likidong nitrogen at nakaimbak sa -80°C.
Humigit-kumulang 100 μg ng natutunaw na cross-linked na protina ay naproseso gamit ang isang binagong filtration sample preparation protocol (FASP) tulad ng inilarawan ni Wisniewski et al.69 Sa madaling sabi, ang protina ay naka-crosslink sa 200 µl ng urea buffer (8 M urea sa 0.1 M Tris, pH 8.5), na-vortex at hinahati.Ang lahat ng mga hakbang sa centrifugation ay isinagawa sa 14,000 xg sa 25 ° C.Ang unang kalahati ng cross-linked protein lysate ay inilipat sa isang 10 kDa Microcon centrifugal filter device na nilagyan ng Ultracel-10 membrane (Merck), na sinusundan ng centrifugation sa filter sa loob ng 25 minuto.Pagkatapos ay idagdag ang pangalawang kalahati ng protina sa filter at ulitin ang parehong mga hakbang.Ang pagbawi ng protina ay isinagawa sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 100 μl ng 17 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) sa urea buffer.Ang pagbawi ay hinalo sa isang thermomixer sa 600 rpm para sa 30 min sa 37 ° C.Bilang karagdagan, ang haligi ay na-centrifuged at ang nabawasan na cross-linked na protina ay na-alkylated gamit ang 100 μl ng 50 mM iodoacetamide sa urea buffer.Ang reaksyon ng alkylation ay isinasagawa sa temperatura ng silid sa loob ng 20 minuto sa dilim.I-rotate ang column, hugasan ang mga dingding ng column ng 3 beses gamit ang 100 µl urea buffer, at pagkatapos ay centrifuge.Ang parehong operasyon ay isinagawa ng 3 beses gamit ang 100 μl ng 100 mM ammonium bikarbonate.Bago ang trypsinization, palitan ang collection tube ng bago.Magdagdag ng digestion buffer na naglalaman ng 50 mM ammonium bicarbonate at 1 µl trypsin na diluted sa trypsin buffer (Promega).Ang ratio ng trypsin sa protina ay pinananatili sa humigit-kumulang 1:33, at ang mga reaksyon ng panunaw ay natupok magdamag sa 37° C. sa isang mamasa-masa na silid.Ang crosslinked peptide ay na-eluted mula sa filter sa pamamagitan ng centrifugation sa loob ng 25 minuto.Ang pagbawi ng peptide ay napabuti sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 50 μl ng 0.5 M NaCl sa filter, na sinusundan ng centrifugation sa loob ng 25 minuto.
Ang C18 Micro Spin columns (Harvard Apparatus) ay ginamit upang mag-desalt ng cross-linked na mga tryptic peptides kasunod ng protocol na inilarawan ni Bouchal et al.70 na may mga menor de edad na pagbabago.Sa madaling sabi, ang mga haligi ng C18 spin ay naisaaktibo na may tatlong paghuhugas ng 0.1% formic acid (FA) sa acetonitrile (AcN) (Merck) at dalawang paghuhugas ng 0.1% FA.Ang column ay na-hydrate ng 0.1% FA sa loob ng 15 minuto.Mag-load ng mga sample sa mga spin column at hugasan ng 3 beses gamit ang 0.1% FA.Ang mga desalted peptides ay sunud-sunod na na-eluted na may stepwise gradient gamit ang 50%, 80% at 100% AcN sa 0.1% FA.Ang mga sample ay pinatuyo sa isang SpeedVac Plus concentrator (Eppendorf) hanggang sa tuluyang mawala ang natitirang likido.Ang mga eluted peptides ay natunaw sa 100 μl ng 0.08% trifluoroacetic acid sa 2.5% AcN at ang mga konsentrasyon ay sinusukat sa isang NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Humigit-kumulang 1 μg ng crosslinked peptide bawat sample ang na-injected sa LC-MS/MS system.
Ang mga cross-linked peptides ay pinaghiwalay sa isang UltiMate 3000 RSLCnano LC system (Thermo Scientific) na konektado sa isang Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific).Ang mga cross-linked na peptide ay nakolekta sa isang 300 µm ID, 5 mm ang haba na µ-pre-column C18 capture column na naka-pack na may C18 PepMap100 sorbent at 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).I-load ang pump flow set sa 5 µl/min 0.08% trifluoroacetic acid na natunaw sa 2.5% AcN.Ang mga cross-linked peptides ay pinaghiwalay sa isang analytical fused silica column na may panloob na diameter na 75 μm at isang haba na 150 mm, na puno ng isang 2 μm na PepMap sorbent (Thermo Scientific).Ang mga mobile phase A at B ay binubuo ng 0.1% FA sa tubig at 0.1% FA sa acetonitrile, ayon sa pagkakabanggit.Nagsisimula ang gradient sa 2.5% B at tumataas nang linear sa 40% B sa loob ng 90 minuto, pagkatapos ay sa 90% B sa susunod na 2 minuto.Ang komposisyon ng mobile phase ay pinananatili sa 90% B sa loob ng 10 minuto at pagkatapos ay bumaba nang linear sa 2.5% B sa loob ng 2 minuto.Ang column ay na-equilibrate sa 2.5% B para sa 8 minuto bago ang susunod na cycle.Ang mga cross-linked peptides na na-eluted mula sa analytical column ay na-ionize sa isang nanoelectrospray ionization (NSI) source at na-injected sa isang Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific).
Ang Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer ay gumana sa positive data correlation mode.Ang isang buong pag-scan ay isinagawa sa section mode sa isang resolution na 120,000 na may mga setting ng hanay mula m/z 350 Th hanggang m/z 2000 Th.Ang normalized na target ng AGC ay itinakda sa 300% na may maximum na oras ng pag-input na 50ms.Ang monoisotopic peak detection ay naitatag para sa mga peptide.Nakatakda sa true ang parameter ng pagpapahinga ng hadlang kung masyadong kakaunti ang mga precursor na makikita.Ang minimum na lakas ng ionic ng precursor ay itinakda sa 5.0e3 at ang precursor charge states hanggang +8 ay kasama sa mga eksperimento.
Ang cycle time sa pagitan ng mga pangunahing pag-scan sa data correlation mode ay itinakda sa 2.5 segundo.Ang dynamic na pagbubukod ng masa ay itinakda sa 20 s pagkatapos ng unang fragmentation ng precursor ion.Ang precursor isolation window ay itinakda sa 2 Th.Ang uri ng normalized collision energy na may fixed collision energy mode ay pinili sa isang data dependent MS/MS scan.Ang enerhiya ng banggaan ay nakatakda sa 30%.Ang resolusyon ng Orbitrap ay itinakda sa 15,000 at ang target ng AGC sa 100%.Ang custom na maximum na oras ng pag-iniksyon ay nakatakda sa 60 milliseconds.
Bago subaybayan ang network ng protina-protein sa mga cross-linked na sample, pinoproseso namin ang mga hilaw na file gamit ang MaxQuant package (bersyon 1.6.12.0)26,27 upang matukoy ang mga traceable na peptides/protein sa mga sample.Bilang karagdagan, ang mga katulad na pagsusuri ng proteomic ay isinagawa sa hindi naka-crosslink na mga sample ng Flo-1 na ginagamot at hindi ginagamot sa IFNα.Hinanap ang data ng MS/MS sa UniProt human database (www.uniprot.org) (na-upload noong Agosto 12, 2020, naglalaman ng 75,093 entry) gamit ang built-in na search engine na Andromeda27.Ang paghahanap ay isinagawa nang hindi nagpapahiwatig ng pagtitiyak ng enzyme at iba't ibang mga pagbabago ng deamidation (N, Q) at oksihenasyon (M).Ang precursor mass tolerances ay itinakda sa 20 ppm at mga ion ng produkto sa 0.02 Da.Ang inisyal at maximum na mass deviation ay itinakda sa 10 ppm.Ang maximum na masa ng peptide ay itinakda sa 4600 Da at ang pagkakapareho ng pagkakasunud-sunod ay itinakda sa pagitan ng 7 at 25 amino acid (aa).Ang karagdagang pagsusuri sa istatistika ay isinagawa gamit ang programang Perseus (bersyon 1.6.10.45).Ang nilalaman ng protina ay kinakalkula sa pamamagitan ng pag-normalize ng spectral intensity ng protina (LFQ intensity; unlabeled quantification)27 at ang mga halaga ng intensity ay na-convert sa Log2.Ang isang hierarchical clustering ng mga protina na kinilala ng kanilang peptide intensity ay binuo gamit ang pheatmap (v1.0.12) na pakete sa R ​​(v 4.1.2).Ang pagsusuri sa pagpapayaman ng landas ay isinagawa gamit ang database ng Reactome pathway para sa mga protina na ginagamot ng IFNα na higit sa apat na beses na naisaaktibo kumpara sa mga hindi ginagamot na sample.
Ang pagkilala sa lysine (K) o serine (S) na tiyak na mga crosslink ng kemikal ng mga complex ng protina na sinusubaybayan ng LC-MS/MS ay isinagawa gamit ang isang spectroscopic identification machine (SIM-XL) para sa cross-linked peptides (SIM-XL)29.Una, ang mga posibleng interaksyon sa pagitan ng interferon-associated (IFN) DNA damage resistance signature (IRDS) genes ay inimbestigahan gamit ang IRDS protein dataset na inilarawan sa Padariya et al.28.Ang pag-screen sa lahat ng kundisyon at pag-uulit ng buong tao na UniProt ay computationally intensive, kaya ang buong database ng tao na UniProt (www.uniprot.org) (na-download noong Agosto 12, 2020, ay naglalaman ng 75,093 entry) laban sa IFNα-treated repeats.Isa sa mga filter para sa mataas na tiwala na mga pakikipag-ugnayan.Ang mga pakikipag-ugnayang ito na may mataas na kahalagahan ay pinalawak at nasubok sa lahat ng mga pag-uulit at kundisyon.
Sa SIM-XL, ginamit ang DSS para sa crosslinker (XL) at ang XL weight shift at modification weight shift ay nakatakda sa 138.06 at 156.07, ayon sa pagkakabanggit.Ang mga sumusunod na crosslinking reaction site ay isinasaalang-alang: KK, KS at KN-TERM, walang reporter ions.Parehong precursor at fragment ppm ay itinakda sa 20 at ang Xrea threshold ay itinakda sa 0.15.Ang Trypsin ay itinuturing na ganap na tiyak, at isang high-energy C-trap (HCD) na paraan ng fragmentation ay ipinatupad.Ang XCorr dynamic DB reduction threshold at ang minimum na bilang ng peptides para sa dynamic na DB reduction ay itinakda sa 2.5 at 2, ayon sa pagkakabanggit.Ang iba pang mga parameter ay: monoisotope probability at peak coincidence cutoff, pinakamababang 4 AA residues sa bawat strand at maximum strand charge, at 3 maxima ng mga hindi nakuhang split.Ang nagresultang stitched 2D na mga mapa ay nasuri sa (SIM-XL) at ang xQuest28 graphical na representasyon ay ginamit upang bumuo ng mga 2D na mapa.Ang mga crosslink ng protina sa mga istruktura ng protina ay ibinibigay sa PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, bersyon 2.0 Schrödinger, LLC).
Ang mga istruktura ng modelo ng protina ay nilikha gamit ang Phyre2 server (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 gamit ang mga prinsipyo ng pagmomodelo ng homology at pagpapatupad ng "Nakatagong Paraan ng Markov".Ang Phyre2 ay bumubuo ng mga istruktura ng modelo batay sa pagkakahanay ng pagkakasunud-sunod sa mga kilalang istruktura ng protina.Para sa mga protina ng H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, at MDN1, ginamit ang mga istruktura ng template na 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, at 6i2665.Bilang karagdagan, ang istraktura ng AlphaFold71 MX1, UBP18 at ROBO1 ay isinasaalang-alang din.Ang istraktura ng protina ay na-visualize gamit ang BIOVIA Discovery Studio Visualizer package (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) at ang Molecular Operating Environment package (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).