ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Para sa kemikal na sangkap ng Industriya ng Kemikal, Ang kakulangan ng SPECC1L ay humahantong sa pagtaas ng katatagan ng mga pinagdugtong na joints at nabawasan ang pagdanak ng mga cranial neural crest cell.

Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Gumagamit ka ng bersyon ng browser na may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Bilang karagdagan, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipinapakita namin ang site na walang mga istilo at JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Para sa Industriya ng Kemikal

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ay isang nangungunang tagagawa na dalubhasa sa hindi kinakalawang na asero na walang tahi na mga tubo, maliwanag na annealed na tubo, walang tahi na nakapulupot na tubing atbp.Upang mapadali ang mga customer, mayroon din kaming mga hinang na tubo at tubo.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ay may pinaka advanced na kagamitan sa paggawa at pagsubok.Maaari naming ganap na masiyahan ang iyong pangangailangan.Ayon sa napakahigpit na pamantayan, ang mga tubo na ginawa namin ay laging may tamang OD at WT tolerance.Ang tolerance control ay mahigpit na naaayon sa paggawa ng mga pamantayan.Ang aming mga produkto ay palaging nasiyahan sa mga customer.Ang mga customer na bumili ng aming mga produkto ay lumikha ng mas maraming kita.
a) OD ( Outer Diameter ) : 3.18mm hanggang 101.6mm
b) WT ( Kapal ng Pader ) : 0.5mm hanggang 20mm
c) Haba: Ayon sa pangangailangan ng customer
d) Mga Pamantayan : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 atbp
e) Paraan ng Proseso : ERW, EFW atbp

Mga slider na nagpapakita ng tatlong artikulo sa bawat slide.Gamitin ang likod at susunod na mga pindutan upang lumipat sa mga slide, o ang mga pindutan ng slide controller sa dulo upang lumipat sa bawat slide.
Ang cranial neural crest cells (CNCC) ay bumubulusok sa mga embryonic neural folds at lumilipat sa pharyngeal arches, na bumubuo sa karamihan ng mga midface na istruktura.Ang CNCC dysfunction ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa etiology ng orofacial cleft, isang karaniwang congenital malformation.Heterozygous SPECC1L mutations ay natagpuan sa mga pasyente na may atypical at syndromic clefts.Dito, naiulat namin ang pinahusay na paglamlam ng mga sangkap na canonical adhesive junction (AJ), β-catenin at E-cadherin sa mga kulturang SPECC1L knockdown na mga cell, at ang mga electron micrograph ay nagpapakita ng apical-basal diffusion ng AJ.Upang maunawaan ang papel ng SPECC1L sa craniofacial morphogenesis, lumikha kami ng isang modelo ng mouse na kulang sa Specc1l.Ang mga homozygous mutants ay embryonic lethal at nagpapakita ng kapansanan sa pagsasara ng neural tube at CNCC lamination.Ang paglamlam ng protina ng AJ ay nadagdagan sa mutant neural folds.Ang depekto sa AJ na ito ay pare-pareho sa isang depekto sa delamination ng CNCC, na nangangailangan ng paglusaw ng AJ.Bilang karagdagan, ang Specc11 mutants ay nabawasan ang PI3K-AKT signaling at nadagdagan ang apoptosis.Sa vitro, ang banayad na pagsugpo sa pag-sign ng PI3K-AKT sa mga wild-type na cell ay sapat upang mapukaw ang mga pagbabago sa AJ.Mahalaga, ang mga pagbabago sa AJ na sapilitan ng SPECC1L knockdown ay maaaring baligtarin sa pamamagitan ng pag-activate ng PI3K-AKT pathway.Kung pinagsama-sama, iminumungkahi ng mga data na ito na ang SPECC1L, bilang isang nobelang regulator ng PI3K-AKT signaling at AJ biology, ay kinakailangan para sa pagsasara ng neural tube at stratification ng CNCC.
Ang mga cranial neural crest cells (CNCCs) ay naglo-localize sa dorsal neuroectoderm at humiwalay sa neuroepithelium ng pagbuo ng neural folds sa pamamagitan ng isang prosesong kinasasangkutan ng epithelial-mesenchymal transition (EMT)1,2,3.Ang mga premigrating na epithelial CNCC ay nakakagambala sa mga intercellular junction at nagiging mga migrating na mesenchymal CNCC na pumupuno sa una at pangalawang pharyngeal arches at bumubuo sa karamihan ng craniofacial cartilage.Kaya, ang mga gene na kumokontrol sa pag-andar ng CNCC ay kadalasang naaabala sa etiology ng craniofacial congenital anomalies tulad ng orofacial clefts, na kadalasang nakakaapekto sa 1/800 na panganganak sa US lamang.Isa sa mga congenital deformities8.
Ang delamination ng CNCC ay kasabay ng pagsasara ng anterior neural tube sa pagitan ng 8.5 at 9.5 na araw ng pag-unlad ng embryonic sa mga daga.Ang mga mutant ng ilang mouse orofacial cleft-associated genes ay nagpapakita rin ng ilang anyo ng neural tube defect, kabilang ang Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, at Pdgfrα12.Gayunpaman, ang mga proseso ng pagsasara ng neural tube at stratification ng CNCC ay maaaring ituring na independyente, dahil ang Splotch mutant mouse (Pax3) ay nagpapakita ng mga depekto sa pagsasara ng neural tube nang walang anumang epekto sa CNCC stratification o migration 13,14.Ang karagdagang mga modelo ng mouse na may mga depekto sa CNCC dissection at neural tube closure ay makakatulong na ilarawan ang karaniwang molekular na batayan ng dalawang prosesong ito.
Ang paghihiwalay ng CNCC mula sa mga neuroepithelial cells ay nangangailangan ng dissolution ng adhesive junctions (AJs), na binubuo ng mga protein complex na naglalaman, bukod sa iba pa, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, at α-actinin na nauugnay sa actin filament 2 . Ang mga overexpression na pag-aaral na E-cadherin sa neural folds ay nagpakita ng pagbawas o pagkaantala sa delamination ng CNCC.Sa kabaligtaran, ang pagsugpo sa E-cadherin ay nagreresulta sa maagang stratification15,16.Marami sa mga salik na namamagitan sa EMT sa panahon ng stratification ng CNCC ay mga transcription factor (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) at extracellular matrix (ECM) remodeling proteins gaya ng matrix metalloproteinases (MMPs), gayunpaman, ang mga CNCC ay direktang cytoskeletal AJ regulators ay hindi pa kilala.Ang PI3K-AKT pathway ay kilala na sumasalungat sa mga antas ng E-cadherin, pangunahin mula sa pananaliksik sa kanser17.Ipinakita ng mga kamakailang pag-aaral na ang pagkawala ng PDGFα-based na PI3K-AKT signaling sa mga daga ay humahantong sa mga abnormalidad ng craniofacial, kabilang ang cleft palate at neural tube defect12.Gayunpaman, ang ugnayan sa pagitan ng landas ng PI3K-AKT at katatagan ng AJ sa stratification ng CNCC ay hindi malinaw.
Natukoy namin dati ang SPECC1L bilang unang mutant gene sa dalawang tao na may matinding cleft na umaabot mula sa bibig hanggang sa mata, na kilala bilang oblique cleft (ObFC) o Tessier IV18 cleft.Natukoy ang mga mutasyon ng SPECC1L sa dalawang multigenerational na pamilya na may autosomal dominant na Opitz G/BBB syndrome (OMIM #145410), kung saan ang mga apektadong indibidwal ay nagpakita ng hyperdistance at cleft lip/palate19, at sa isang pamilya na may Tibi overdistance syndrome (OMIM #145420)20 .higit sa kalahati ng mga kaso ng Opitz G/BBB syndrome ay X-linked (OMIM #300000) at sanhi ng mga mutasyon sa MID1 gene, na nag-encode ng protina 22 ng microtubule-associated cell skeleton.Ipinagpalagay namin na ang SPECC1L, isa ring protina na nauugnay sa mga microtubule at actin cytoskeleton, ay maaaring mamagitan ng pagsenyas na kinakailangan para sa pag-remodel ng actin cytoskeleton sa panahon ng pagdikit ng cell at paglipat 18 .Sa pamamagitan ng in vitro at in vivo na pag-aaral, inilalarawan namin ngayon ang SPECC1L bilang isang nobelang regulator ng katatagan ng AJ sa pamamagitan ng PI3K-AKT signaling.Sa antas ng cellular, ang kakulangan ng SPECC1L ay nagresulta sa isang pagbawas sa antas ng pan-AKT na protina at isang pagtaas sa apical-basal dispersion ng AJ, na inalis ng kemikal na pag-activate ng AKT pathway.Sa vivo, ang Specc11-deficient embryo ay nagpapakita ng kapansanan sa pagsasara ng neural tube at nabawasan ang CNCC dissection.Kaya, ang SPECC1L ay gumagana sa mataas na regulated cell adhesion-based signaling na kinakailangan para sa normal na CNCC function sa panahon ng facial morphogenesis.
Upang makilala ang papel ng SPECC1L sa antas ng cellular, ginamit namin ang naunang inilarawan na matatag na osteosarcoma cell line na U2OS na kulang sa SPECC1L18.Ang mga stable na U2OS cells na ito na may SPECC1L (kd) knockdown ay may katamtaman (60–70%) na pagbaba sa mga antas ng SPECC1L transcript at mga protina, kasama ang mga depekto sa migration at reorganization ng actin cytoskeleton 18. Sa kabaligtaran, isang matinding lumilipas na pagbaba sa Ang SPECC1L ay ipinakita na humantong sa mitotic defects 23 .Sa karagdagang pagkilala, natagpuan namin na ang aming matatag na mga cell ng SPECC1L-kd ay nagbago ng morpolohiya sa isang napakataas na antas ng pagsasama (Larawan 1).Ang mga indibidwal na control cell at kd cells sa mababang confluence ay magkatulad (Larawan 1A, D).24 na oras pagkatapos ng pagsasanib, ang mga control cell ay nagpapanatili ng kanilang cuboidal na hugis (Larawan 1B, E), habang ang mga cell ng SPECC1L-kd ay pinahaba (Larawan 1C, F).Ang lawak ng pagbabagong ito sa hugis ng cell ay nakunan ng in vivo live imaging ng mga control cell at kd cells (pelikula 1).Upang matukoy ang papel ng SPECC1L sa mga confluent cells, sinuri muna namin ang pagpapahayag nito.Natagpuan namin na ang mga antas ng protina ng SPECC1L ay tumaas sa pagsasanib (Larawan 1G), samantalang ang mga antas ng transcript ng SPECC1L ay hindi tumaas (Larawan 1H).Bilang karagdagan, habang tumataas ang density ng cell, naipon ang protina ng SPECC1L sa mga intercellular boundaries (Fig. 2A-E), na may pattern na nagsasapawan sa β-catenin na nauugnay sa lamad (Fig. 2A'-E').Ibinigay ang kaugnayan ng SPECC1L sa actin cytoskeleton 18, 23 na hypothesize namin na ang SPECC1L ay nakikipag-ugnay sa actin-based adhesive junctions (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) cells ay humahaba sa mataas na confluence (F) kumpara sa control U2OS cells (AC).Ipinapakita rito ang tatlo sa anim na time point (T1, T3, T6) na pinili namin para sa iba't ibang densidad ng cell.(G) Western blot analysis na nagpapakita na ang SPECC1L protein ay nagpapatatag sa isang mataas na antas ng confluence kumpara sa isang mababang antas ng confluence sa mga control cell.Ipinapakita ng Western blot ng SPECC1L ang inaasahang 120 kDa band at mas mataas na molecular weight band, posibleng post-translationally modified (*).Ang pagsusuri sa Western blot ay isinagawa sa ilalim ng parehong mga kondisyon para sa mababa at mataas na kumpol.Ang mga larawang nagpapakita ng SPECC1L sa mababa at mataas na kumpol ay kinuha mula sa parehong blot.Ang parehong blot ay tinanggal at muling sinuri gamit ang β-actin antibody.(H) Ang pagsusuri sa dami ng RT-PCR ay nagpakita ng walang makabuluhang pagbabago sa mga antas ng transcript ng SPECC1L.Ang mga error bar ay kumakatawan sa mga SEM mula sa apat na independiyenteng mga eksperimento.
(AE) Pumili kami ng anim na mga puntos ng oras (T1-T6) na kumakatawan sa isang hanay ng mga density ng cell upang gawing normal ang pagsusuri ng hugis ng cell at mga pagbabago sa AJ sa mga cell ng U2OS na may SPECC1L knockdown (kd).Kasama sa unang limang mga punto ng oras na ito ang mga solong cell (T1), 50-70% na pagsasanib ng maliliit na kumpol ng cell (T2), pagsasanib nang hindi muling hinuhubog ang mga kd cells (T3), muling paghuhubog ng mga kd cells (T4), at 24 na oras na pagbabago.sa posterior form ng kd (T5) cells.Ang protina ng SPECC1L ay higit na nakakalat sa cytoplasm sa T1 (A), ngunit ang akumulasyon nito ay naobserbahan sa mga intercellular na hangganan sa kasunod na mga oras ng oras (B-E, mga arrow).(FJ) β-catenin ay nagpapakita ng magkatulad na akumulasyon sa mga intercellular na hangganan na nauugnay sa AJ complex.(A'-E') SPECC1L at β-catenin ay nagpapakita ng magkakapatong na paglamlam sa mga hangganan ng cell sa mataas na density ng cell (mga arrow).(F'-J') Sa mga cell ng SPECC1L-kd, ang paglamlam ng β-catenin ay lumilitaw na normal sa mababang density ng cell (F'-H'), ngunit lumalawak habang nagbabago ang hugis ng cell (I', J'; mga arrow), na nagpapahiwatig na ang AJ nagbago.Mga Bar = 10 µm.
Pagkatapos ay sinubukan naming matukoy ang epekto ng kakulangan sa SPECC1L sa AJ.Gumamit kami ng ilang mga marker na nauugnay sa AJ, kabilang ang mga canonical na sangkap na F-actin, myosin IIb, β-catenin, at E-cadherin24,25,26,27.Ang mga fibers ng stress ng actin ay tumaas sa mga cell ng SPECC1L-kd tulad ng inilarawan dati (Larawan 3A, B) 18 .Ang Myosin IIb na nauugnay sa mga filament ng actin ay nagpakita ng katulad na pagtaas sa mga cell ng SPECC1L-kd sa vitro (Larawan 3C, D).Ang β-catenin na nauugnay sa AJ ay nagbubuklod sa cadherin sa lamad ng cell, na nagpapakita ng isang normal na pattern ng expression ng "honeycomb" sa control cubocytes (Fig. 3E, G).Kapansin-pansin, sa mga flat na imahe gamit ang confocal microscopy, ang paglamlam ng β-catenin (Fig. 3E, F) at E-cadherin (Fig. 3G,H) sa cell membrane ng mga confluent na cell na kulang sa SPECC1L ay nagpakita ng mga kilalang pattern ng pinahabang paglamlam.Ang pagpapalawak na ito ng AJ-associated β-catenin staining sa kd cells ay pinaka-binibigkas sa confluence, ngunit lumilitaw na nauna sa mga pagbabago sa hugis ng cell (Larawan 2F-J, F'-J').Upang matukoy ang pisikal na katangian ng pinalawak na paglamlam ng AJ na ito, sinuri namin ang mga hangganan ng cell sa apical-basal na ibabaw ng SPECC1L-kd U2OS cells sa pamamagitan ng transmission electron microscopy (TEM) (Larawan 3I, J).Sa kaibahan sa control cells (Fig. 3I), na may hiwalay na electron siksik na rehiyon na nagpapahiwatig ng AJ (arrow), ang kd cells (Fig. 3J) ay nagpakita ng malaki, magkadikit na mga rehiyon ng mataas na electron density na nagpapahiwatig ng AJ kasama ang apicobasal plane..Bilang karagdagan, sa mga transverse na seksyon, napansin namin ang malawak na cell membrane folds sa kd cells (Fig. S1A,B), na nagpapaliwanag sa pinahabang pattern ng β-catenin at E-cadherin staining bands (Fig. 3F,H).Bilang suporta sa papel ng SPECC1L sa AJs, ang β-catenin ay co-immunoprecipitated kasama ang SPECC1L sa lysates ng mga confluent na U2OS cells (Fig. 3K).Kasama ng pinalawig na immunostaining para sa mga marker ng AJ, ang pagsusuri ng TEM ay naaayon sa aming hypothesis na ang kakulangan sa SPECC1L ay nagdaragdag ng AJ apical-basal density at pagkakaiba-iba.
(AH) Tumaas na F-actin staining sa kd cells sa 48 oras na post-fusion (T6; A, B).Binagong paglamlam ng myosin IIb na nauugnay sa F-actin (C, D).Ang makinis na pattern ng β-catenin at E-cadherin membrane staining sa control cells (E, G) ay pinahusay sa SPECC1L-kd (F, H) cells.Mga Bar = 10 µm.(I-J) Ang mga electron micrograph na nagmamasid sa apical-basal intercellular junction.Ang mga control cell ay nagpapakita ng natatanging mga electron-dense na rehiyon na nagpapahiwatig ng mga malagkit na junction (I, mga arrow).Sa kaibahan, ang buong apical-basal junction sa SPECC1L-kd cells ay lumitaw na siksik ng elektron (J, arrow), na nagpapahiwatig ng pagtaas ng density at pagpapakalat ng mga adhesive junctions.(K) Ang β-catenin ay co-immunoprecipitated kasama ang SPECC1L sa confluent U2OS cell lysates.Kinuha ang larawan mula sa isang lugar na kumakatawan sa isa sa apat na independiyenteng eksperimento.
Upang maunawaan ang papel ng SPECC1L sa craniofacial morphogenesis, lumikha kami ng isang Specc1l deficient na modelo ng mouse gamit ang dalawang independiyenteng ES trap cell lines, DTM096 at RRH048 (BayGenomics, CA), na kumakatawan sa intron 1 at Specc1l transcript ay nakunan sa 15 (Fig. 1) .4A, figure S2).Ang genomic na lokasyon ng decoy vector insert ay tinutukoy ng buong genome sequencing at nakumpirma ng PCR (Fig. S2).Ang parehong mga disenyo ng gene trap ay nagpapahintulot din sa in-frame na pagsasanib ng mga reporter ng Specc11-lacZ nang makunan.Samakatuwid, ang expression ng lacZ na tinutukoy ng X-gal staining ay ginamit bilang isang tagapagpahiwatig ng expression ng Specc11.Ang parehong mga alleles ay nagpakita ng magkatulad na mga pattern ng expression ng lacZ, na may DTM096 gene trap sa intron 1 na nagpapakita ng mas malakas na pagpapahayag kaysa sa RRH048 sa intron 15 (hindi ipinakita).Gayunpaman, ang Specc1l ay malawak na ipinahayag, na may partikular na malakas na pagpapahayag sa neural folds sa E8.5 (Larawan 4B), sa neural tube at facial na proseso sa E9.5 at E10.5 (Larawan 4C, D), at sa pagbuo ng mga limbs sa E10.5 at mga mata (Figure 4D).Nauna naming naiulat na ang expression ng SPECC1L sa unang pharyngeal arch sa E10.5 ay naroroon sa epithelium at pinagbabatayan na mesenchyme18, na naaayon sa linya ng CNCC.Upang subukan ang SPECC1L expression sa CNCC, nagsagawa kami ng E8.5 neural folds (Larawan 4E-J) at E9.5 na mga seksyon ng bungo (Larawan 4K-).Sa E8.5, ang SPECC1L ay nabahiran ng neural folds nang matindi (Fig. 4E, H), kasama ang mga cell na nabahiran ng mga NCC marker (Fig. 4G, J).Sa E9.5, ang SPECC1L (Fig. 4K, N) ay malakas na nabahiran ng migrating CNCC co-stained na may AP2A (Fig. 4L, M) o SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Schematic representation ng mouse Specc11 gene na nagpapakita ng decoy vector insertion sa ES DTM096 (intron 1) at RRH048 (intron 15) na mga cell clone.(BD) lacZ staining ng heterozygous Specc1lDTM096 embryo na kumakatawan sa Specc1l expression mula E8.5 hanggang E10.5.NE = neuroectoderm, NF = neural fold, PA1 = unang pharyngeal arch.(EP) SPECC1L immunostaining na may mga NCC marker AP2A at SOX10 sa E8.5 (NF; EJ) neural folds at E9.5 (KP) na mga seksyon ng bungo.Ang paglamlam ng SPECC1L ay malawak na naobserbahan sa neural folds E8.5 (E, H; arrowheads), kabilang ang mga cell na may label na AP2A (F, G; arrowheads) at SOX10 (I, J; arrowheads).Sa E9.5, malakas na nabahiran ng SPECC1L ang mga migrating na CNCC (K, N; arrow) na may label na AP2A (L, M; arrow) at SOX10 (O, P; arrow).
Ang pagtawid sa pagitan ng heterozygous Specc1lDTM096/+ at Specc1lRRH048/+ na mga daga ay nagpapakita na ang dalawang gene trap alleles ay hindi komplementaryo at ang tambalang heterozygotes at embryonic homozygotes para sa alinman sa gene trap allele ay embryonic lethal (Talahanayan S1).Ang mga ratio ng Mendelian ay nagpahiwatig ng pagbaba sa survival rate ng mga heterozygotes sa kapanganakan (inaasahang 1.34 kumpara sa 2.0).Napansin namin ang mababang perinatal mortality sa mga heterozygotes, ang ilan ay may craniofacial anomalies (Fig. S3).Gayunpaman, ang mababang pagtagos ng mga perinatal craniofacial phenotype na ito ay nagpapahirap sa pag-aaral ng kanilang pinagbabatayan na mga mekanismo ng pathophysiological.Samakatuwid, nakatuon kami sa embryonic lethal phenotype ng homozygous Specc11 mutants.
Karamihan sa mga compound heterozygous o homozygous Specc1lDTM096/RRH048 mutant embryo ay hindi nabuo pagkatapos ng E9.5–10.5 (Fig. 5A–D), at ang neural tube ay hindi nagsara sa harap (Fig. 5B, D) at minsan ay nakasara sa likuran (hindi ipinapakita) ..Ang cranial neural tube closure defect na ito ay nauugnay sa karamihan ng CNCC na minarkahan ng DLX2 na natitira sa neural folds sa E10.5, na nagpapahiwatig ng walang dissection (Larawan 5A'-D').Upang matukoy kung ang kabuuang sukat ng CNCC ay nabawasan din, na-tag namin ang mga linya ng CNCC na may GFP sa aming mga linya ng gene trap na may Wnt1-Cre at ROSAmTmG.Nag-stream kami ng pinagsunod-sunod na GFP+ NCC at GFP- (RFP+) na hindi NCC mula sa mga buong embryo.Sa E9.5, ang proporsyon ng flow-sorted GFP-labeled CNCCs ay hindi nagbago nang malaki sa pagitan ng WT at mutant embryo (hindi ipinakita), na nagpapahiwatig ng normal na detalye ng CNCC.Samakatuwid, na-hypothesize namin na ang natitirang paglamlam ng Wnt1-Cre at DLX2 sa nakalantad na neural folds (Larawan 5B ') ay dahil sa may sira na CNCC layering, posibleng dahil sa pagtaas ng density o pagpapakalat ng mga AJ cells, tulad ng nakikita sa mga cell ng SPECC1L-kd.Ginamit namin ang mga NCC marker na SOX10, AP2A, at DLX2 upang kumpirmahin ang pagkakaroon ng CNCC sa neural fold (Larawan 5E-R).Sa E8.5, ang neural fold staining para sa lahat ng tatlong NCC marker ay na-obserbahan sa mga seksyon ng WT (Fig. 5E, G, I) at Specc1l mutant (Fig. 5F, H, J).Sa E9.5, habang ang mga marker ng NCC ay may mantsa ng paglipat ng NCC sa mga seksyon ng WT (Larawan 5M, O, Q), ang natitirang paglamlam ng NCC ay naobserbahan sa mga nakalantad na neural folds ng Specc1l mutant embryo (Larawan 5N, P, R).Dahil ang SOX10 at DLX2 ay nagmamarka ng paglilipat ng mga CNCC, ang resultang ito ay nagmumungkahi na ang SPECC1L-deficient na mga CNCC ay nakakamit ng post-migratory na detalye ngunit nabigong lumipat mula sa neural folds.
Ang kakulangan sa Specc11 ay humahantong sa may sira na pagsasara ng neural tube, delamination ng cranial neural crest cells at AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryo na nagdadala ng migrating cranial neural crest cells (CNCC) na may label na Wnt1-Cre (A').Sa kaibahan, ang Specc11 mutant embryo ay nagpapakita ng mga bukas na neural folds (B), arrowheads) at CNCCs na hindi pa lumipat (B', arrowheads).(C, D') Maliwanag na mga larawan sa field (C, D') at immunostaining (C', D') ng CNCC marker DLX2 ng E10.5 WT embryo (C, C') at Specc1l (D, D').Sa WT E10.5 na mga embryo, ang DLX2-positibong CNCC ay kolonisahan ang mga arko ng hasang (C', arrow), habang sa mga mutant, ang kapansin-pansing paglamlam ay nagpapatuloy sa mga bukas na neural folds (D', arrow) at sa unang pharyngeal arches (D', mga arrow).) na may ilang paglamlam (mga arrow) na nagpapahiwatig ng mahinang delamination at paglipat ng CNCC.ER) Ang mga seksyon ng WT at Specc1l mutant embryo sa mga yugto ng E8.5 (E–L) at E9.5 (M–R) ay may label na NCC marker SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) at DLX2 (I, J, Q, R).Sa E8.5, ang paglamlam ng NCC ay naobserbahan sa mga wild-type na neural fold (NF) at mga seksyon ng mutant.Ang co-staining ng SOX10 at β-catenin sa E8.5 WT (K) at mutant (L) ay nagsiwalat ng pagtaas ng β-catenin staining sa mga hangganan ng cell sa neural folds.Sa E9.5, ang wild-type staining ng migrating CNCCs (M, O, Q) ay naobserbahan, habang sa mga mutant, ang mga unstratified CNCCs ay nabahiran ng bukas na neural folds (N, P, R).(S–Z) In vivo AJ labeling analysis sa coronal section ng WT at Specc11DTM096/RRH048 na mga embryo na may E9.5 mutation.Ang isang tinatayang sectional plane ay ipinapakita sa kanang sulok sa itaas.Sa mga seksyon ng mutant tissues, ang pagtaas ng paglamlam ng F-actin (S, T) at myosin IIb (U, V) ay naobserbahan.Katulad ng mga resulta ng in vitro sa Fig. 3, sa mga mutant embryo, ang pinahusay na paglamlam ng lamad para sa β-catenin (W, X) at E-cadherin (Y, Z) ay naobserbahan.(AA-BB) Ang isang electron micrograph ng isang seksyon ng isang wild-type na embryo na tumitingin sa kabila ng hangganan ng apical-basal cell ay nagpapakita ng isang natatanging electron-dense na rehiyon na nagpapahiwatig ng mga adhesive junction (AA, mga arrow).Sa kaibahan, sa mga seksyon ng Specc11 mutant embryos (BB, arrow), ang buong apicobasal junction ay electron siksik, na nagpapahiwatig ng isang pagtaas ng density at pagpapakalat ng mga adhesive junction.
Upang subukan ang aming hypothesis na ang pinababang layering ay dahil sa binagong AJ, sinuri namin ang pag-label ng AJ sa mga nakalantad na neural folds ng Specc1l mutant embryo (Fig. 5S-Z).Napansin namin ang pagtaas ng mga fibers ng stress ng actin (Fig. 5S, T) at isang kasabay na pagtaas ng localization ng myosin IIB staining sa actin fibers (Fig. 5U, V).Mahalaga, napansin namin ang pagtaas ng paglamlam ng β-catenin (Larawan 5W, X) at E-cadherin (Larawan 5Y, Z) sa mga intercellular na hangganan.Sinuri din namin ang β-catenin staining ng NCC sa neural folds ng E8.5 embryos (Larawan 5K, L).Lumilitaw na mas malakas ang paglamlam ng β-catenin sa Specc1l mutant neural folds (Fig. 5L at K), na nagmumungkahi na nagsimula na ang mga pagbabago sa AJ.Sa mga electron micrographs ng mga skull section ng E9.5 embryo, muli naming napansin ang pagtaas ng diffuse electron-dense staining sa Specc1l mutant embryos kumpara sa WT (Fig. 5AA, BB at S1E-H).Kung sama-sama, sinusuportahan ng mga resultang ito ang aming mga in vitro na resulta sa SPECC1L-kd U2OS cells at iminumungkahi na ang aberrant AJ staining ay nauuna sa stratification ng CNCC sa aming mga mutant embryo.
Dahil sa kilalang antagonistic na relasyon sa pagitan ng aktibidad ng AKT at katatagan ng E-cadherin, 17, 28 namin ang hypothesize ng paglahok ng PI3K-AKT signaling.Bilang karagdagan, napansin namin ang subepidermal blistering sa ilan sa aming mga mutant embryo na nakatakas sa lethality (<5%) sa E9.5-10.5 at sa halip ay nanirahan sa paligid ng E13.5 (Fig. S3).Ang mga subepidermal vesicle ay isang tanda ng pinababang PI3K-AKT signaling batay sa PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) ay nag-ulat na ang pagkagambala ng PDGFRα-based na PI3K activation sa PdgfraPI3K/PI3K mutant embryos ay nagreresulta sa mga subepidermal vesicle, neural tube defect, at cleft palate phenotypes.Sa katunayan, ang mga antas ng pan-AKT at aktibong phosphorylated Ser473-AKT ay nabawasan sa vivo sa Specc1l mutant tissues sa E9.5 embryonic arrest (Fig. 6A-D).Ang pagbaba sa mga antas ng phosphorylated Ser473-AKT ay maaaring ganap na dahil sa pagbaba ng mga antas ng pan-AKT sa vivo (FIG. 6E) at in vitro (FIG. 6F).Ang isang pagbawas sa vitro ay naobserbahan lamang kapag ang mga cell ng U2OS ay malakas na nakakaugnay sa mga pagbabago sa hugis ng cell at density ng AJ (Larawan 6D).Kaya, iminumungkahi ng aming data na ang SPECC1L ay isang nobelang positibong regulator ng PI3K-AKT signaling sa craniofacial morphogenesis.
(A–E) E8.5 (A,B) at E9.5 (C,D) na mga seksyon ng bungo o E9.5 lysates mula sa Specc1l mutant embryo (E) na nagpapakita ng mga antas ng aktibong phosphorylated S473-AKT at pan-AKT Protein reduction , kumpara sa control WT.Ang Western blotting ay isinagawa sa wild-type lysates at mutant lysates sa ilalim ng parehong mga kondisyon.Ang mga larawang ipinakita para sa SPECC1L ay kinuha mula sa isang blot.Ang parehong blot ay tinanggal at muling napagmasdan na may mga anti-pan-ACT at β-actin antibodies.Ang mga antas ng Pan-AKT sa E8.5 neural folds (A, B) at mga antas ng phosphorylated S473-AKT sa mga seksyon ng bungo ng E9.5 ay makabuluhang nabawasan.(F) Ang mga antas ng Pan-AKT ay katulad na nabawasan sa mga lysate ng SPECC1L-kd U2OS na mga cell na na-ani sa mataas na pagsasama.Ang mga error bar ay kumakatawan sa mga SEM mula sa tatlong independiyenteng Western blot quantification.(GJ) Ang mga seksyon ng WT embryo sa E9.5 na may mantsa ng KI67 at cleaved caspase 3, ayon sa pagkakabanggit, na nagpapakita ng paglaganap ng cell (G, G ') at maliit na apoptotic na aktibidad (H, H ').Ang specc11 mutant embryo ay nagpapakita ng maihahambing na paglaganap ng cell (I), ngunit ang bilang ng mga cell na sumasailalim sa apoptosis ay makabuluhang nadagdagan (J).
Pagkatapos ay sinuri namin ang mga marker ng paglaganap at apoptosis.Wala kaming nakitang pagkakaiba sa paglaganap ng E9.5 embryo (Fig. 6E, G kumpara sa I) na may proliferation index na 82.5% para sa WT mutants at 86.5% para sa Specc1l mutants na sinusukat ng KI67 staining (p <0.56, Fisher's eksaktong pagsubok).Katulad nito, hindi namin napansin ang anumang pagkakaiba sa apoptosis na sinusukat sa pamamagitan ng paglamlam para sa cleaved caspase 3 sa neural folds sa E8.5 hanggang sa pag-aresto sa embryo (hindi ipinakita) (hindi ipinakita).Sa kaibahan, ang apoptosis ay makabuluhang nadagdagan sa lahat ng E9.5 mutant embryo (Larawan 6F, H at J).Ang pangkalahatang pagtaas sa apoptosis ay naaayon sa nabawasan na PI3K-AKT signaling at maagang embryonic lethality29,30,31.
Susunod, upang kumpirmahin ang isang sanhi ng papel para sa pag-sign ng PI3K-AKT sa mga pagbabago sa AJ sa aming mga kd cells, binago namin ng kemikal ang landas sa control at kd cells (Larawan 7A-F).Ginamit namin bilang marker ang phenotype ng pagbabago ng hugis ng cell na naobserbahan sa mga confluent na SPECC1L-kd cells, na binibilang namin gamit ang ratio ng pinakamahabang dimensyon (haba) sa kaukulang vertical na dimensyon (lapad).Ang ratio na 1 ay inaasahan para sa medyo bilog o cuboidal na mga cell (Larawan 7G).Bilang karagdagan sa hugis ng cell, kinumpirma din namin ang epekto sa AJ sa pamamagitan ng paglamlam ng β-catenin (Larawan 7A'-F').Ang pagsugpo sa landas ng PI3K-AKT gamit ang wortmannin ay sapat na upang baguhin ang hugis ng cell sa mga control cell (Larawan 7A, C) at AJ (Larawan 7A ').Ang PI3K-AKT activator SC-79 ay hindi nakaapekto sa hugis ng cell (FIG. 7A, E) o AJ expansion (FIG. 7A') sa mga control cell.Sa mga cell ng SPECC1L-kd, ang karagdagang pagsugpo sa landas ng PI3K-AKT ay nagresulta sa pagtaas ng apoptosis (Larawan 7B, D) at isang minarkahang pagtaas sa paglamlam ng β-catenin (Larawan 7B '), na naaayon sa aming mga mabibigat na mutant sa vivo.Mahalaga, ang pag-activate ng landas ng PI3K-AKT ay makabuluhang napabuti ang hugis ng cell (Larawan 7B, F) at AJ phenotypes (Larawan 7B ").Ang mga pagbabago sa hugis ng cell ay binibilang bilang cell roundness ratio (CCR) at inihambing para sa kahalagahan tulad ng inilarawan sa itaas (FIG. 7G).Sa katunayan, sa mga control cell (Larawan 7G, CCR = 1.56), sapat na ang paggamot sa wortmannin upang makabuluhang baguhin ang hugis ng cell (Larawan 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) sa lawak na katulad ng naobserbahan. sa SPECC1L.-kd cells (Larawan 7G, CCR = 3.46).Wortmannin treatment ng SPECC1L-kd cells (Fig. 7G, CCR = 3.60, negligible) ay hindi mas makabuluhan kaysa sa untreated kd cells (Fig. 7G, CCR = 3.46, negligible) o wortmannin-treated control cells (Fig. 7G)., CCR = 3.46, bale-wala) ay nakakaapekto sa pagpapahaba ng cell (7G, CCR = 3.61, bale-wala).Pinakamahalaga, naibalik ng SC-79 AKT activator ang pinahabang phenotype ng SPECC1L-kd cells (Fig. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Kinukumpirma ng mga resultang ito na kinokontrol ng SPECC1L ang pagsenyas ng PI3K-AKT at iminumungkahi na ang isang katamtamang pagbaba sa SPECC1L ay nakakaapekto sa pagdirikit ng cell, habang ang isang malakas na pagbaba ay humahantong sa apoptosis (Fig. 8).
(A–F') Control (A, C, E) at SPECC1L-kd (B, D, F) na mga cell na ginagamot sa PI3K-AKT pathway inhibitor wortmannin (C, D) o SC-79 activator (E, F) na Paggamot .Ang mga hindi ginagamot na control cell ay cuboidal (A) na may normal na β-cat cellular staining (A'), habang ang kd cells ay pinahaba (B) na may tumaas na β-cat staining (B').Matapos ang pagsugpo sa landas ng PI3K-AKT, ang mga control cell ay pinahaba (C) na may pagpapalawak ng β-cat (C'), habang ang mga kd cells ay nagsimulang sumailalim sa apoptosis (D), katulad ng aming mga highly mutated embryo at nagpapakita ng labis na pinahusay na β-cat.paglamlam (D').Matapos ang pag-activate ng landas ng PI3K-AKT, ang mga control cell ay nanatiling cuboidal (E) at may normal na paglamlam ng β-cat (E'), habang ang mga kd cells ay nagpakita ng makabuluhang pinabuting hugis ng cell (F) at β-cat (F') na paglamlam, na nagpapahiwatig (G) Ang antas ng pagbabago ng hugis ng cell sa (AF) ay na-quantified gamit ang cell roundness ratio (CCR) ng pinakamahabang dimensyon (haba) at ang kaukulang vertical na dimensyon (lapad) gamit ang MetaMorph software.Hindi ginagamot (NT) SPECC1L-kd cells (CCR = 3.46) ay makabuluhang mas mahaba kaysa sa mga control cell (CCR = 1.56, p <6.1 × 10–13).Ang pagsugpo ni Wort sa landas ng PI3K-AKT sa mga control cell ay sapat upang maging sanhi ng isang katulad na pagpahaba sa hugis ng cell (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).Katulad nito, ang pag-activate ng AKT ng SC-79 sa mga cell ng SPECC1L-kd ay naibalik ang pagpapahaba ng cell upang makontrol ang mga antas (CCR = 1.74, p <6.2 × 10–12).Wortmannin treatment ng SPECC1L-kd cells ay nagresulta sa tumaas na apoptosis ngunit walang karagdagang pagtaas sa cell shape change (CCR=3.60) kumpara sa untreated kd (CCR=3.46, ns) o wortmannin-treated control cells (3.61) na naobserbahan sa .ns = hindi mahalaga.+/- Ang mga sukat ng SEM para sa 50 mga cell ay ipinapakita.Ang mga pagkakaiba sa istatistika ay kinakalkula gamit ang t-test ng Mag-aaral.
(A) Schematic na representasyon ng pagsugpo at pag-activate ng PI3K-AKT na landas na nagreresulta sa mga pagbabago at pagliligtas ng AJ, ayon sa pagkakabanggit.(B) Iminungkahing modelo para sa pag-stabilize ng protina ng AKT ng SPECC1L.
Ang mga premigratory CNCC ay nangangailangan ng AJ lysis na humiwalay mula sa anterior neural fold neuroepithelial cells1,15,32.Ang pagtaas ng paglamlam ng mga bahagi ng AJ at pagkawala ng apical-basal AJ asymmetric distribution sa SPECC1L-deficient na mga cell parehong in vitro at in vivo, na sinamahan ng pisikal na kalapitan ng SPECC1L sa β-catenin, ay nagmumungkahi na ang SPECC1L ay gumagana upang maayos na mapanatili ang AJ lokal na katatagan para sa mga kalamnan ng organisasyon.actin cytoskeleton.Ang kaugnayan ng SPECC1L sa actin cytoskeleton at β-catenin at ang pagtaas sa bilang ng mga condensed actin filament sa kawalan ng SPECC1L ay naaayon sa naobserbahang pagtaas sa AJ density.Ang isa pang posibilidad ay ang pagtaas ng bilang ng mga actin fibers sa SPECC1L-deficient na mga cell ay humahantong sa pagbabago sa intercellular tension.Dahil ang cellular stress ay nakakaapekto sa AJ 33 dynamics, ang mga pagbabago sa boltahe ay maaaring magresulta sa mas nagkakalat na AJ 34 .Kaya ang anumang mga pagbabago ay makakaapekto sa mga layer ng CNCC.
Ang Wnt1 ay ipinahayag sa mga maagang neural folds na nagdudulot ng mga neural crest cells.Kaya, ang Wnt1-cre lineage tracing ay nagmamarka ng parehong bago at paglipat ng NCC35.Gayunpaman, minarkahan din ng Wnt1 ang mga clone ng dorsal brain tissue na nagmula rin sa maagang neural folds 35,36 , na ginagawang malamang na ang aming paglamlam ng E9.5 mutants para sa mga marker ng Wnt1 sa open neural folds ay hindi CNCC.Ang aming positibong paglamlam para sa mga marker ng NCC AP2A at SOX10 ay nakumpirma na ang nakalantad na neural folds ng Specc11 mutant embryo ay talagang naglalaman ng CNCC.Bilang karagdagan, dahil ang AP2A at SOX10 ay mga marker ng maagang paglipat ng NCC, ang positibong paglamlam ay nagpahiwatig na ang mga cell na ito ay post-migratory na CNCC na hindi maaaring stratified ng E9.5.
Iminumungkahi ng aming data na ang molekular na regulasyon ng AJ ng SPECC1L ay pinagsama ng PI3K-AKT signaling.Ang pagsenyas ng AKT ay nabawasan sa mga cell at tisyu na kulang sa SPECC1L.Mga natuklasan ni Fantauzzo et al.sumusuporta sa isang direktang papel para sa PI3K-AKT signaling sa craniofacial morphogenesis.(2014) ay nagpakita na ang kakulangan ng pag-activate ng PDGFRα-based na PI3K-AKT signaling ay humahantong sa isang cleft palate phenotype.Ipinakita rin namin na ang pagsugpo sa landas ng PI3K-AKT ay sapat upang baguhin ang AJ at hugis ng cell sa mga cell ng U2OS.Alinsunod sa aming mga natuklasan, Cain et al.37 ay nagpakita na ang downregulation ng PI3K α110 subunit sa mga endothelial cells ay nagreresulta sa isang katulad na pagtaas sa pericellular β-catenin staining, na tinutukoy bilang isang pagtaas sa "index ng koneksyon".Gayunpaman, sa mga endothelial cells na ang mga filament ng actin ay lubos na nakaayos, ang pagsugpo sa landas ng PI3K-AKT ay nagreresulta sa isang maluwag na hugis ng cell.Sa kaibahan, ang mga SPECC1L-kd U2OS na mga cell ay nagpakita ng isang pinahabang hugis ng cell.Ang pagkakaibang ito ay maaaring partikular sa uri ng cell.Habang ang pagsugpo sa PI3K-AKT signaling ay permanenteng nakakaapekto sa actin cytoskeleton, ang epekto sa hugis ng cell ay tinutukoy ng mga pagbabago sa tensyon na dulot ng mga pagbabago sa density at organisasyon ng mga central actin fibers.Sa mga cell ng U2OS, ginamit lang namin ang mga pagbabago sa hugis ng cell bilang isang marker ng pagbabago at pagbawi ng AJ na kulang sa SPECC1L.Sa konklusyon, ipinapalagay namin na ang pagsugpo sa landas ng AKT sa kakulangan ng SPECC1L ay nagdaragdag ng katatagan ng AJ at binabawasan ang delamination sa CNCC.
Kapansin-pansin, ang mga antas ng pan-AKT ay nabawasan sa vitro at sa vivo bilang karagdagan sa mga antas ng phosphorylated 473-AKT sa kawalan ng SPECC1L, na nagmumungkahi ng regulasyon ng PI3K-AKT signaling sa antas ng katatagan ng protina ng AKT o turnover.Ang SPECC1L at MID1 genes, na parehong nauugnay sa Opitz/GBBB syndrome, ay nag-encode ng mga protina na nagpapatatag ng microtubule 18,22 .Ang mekanismo kung saan ang SPECC1L at MID1 ay namamagitan sa pag-stabilize ng microtubule ay hindi lubos na nauunawaan.Sa kaso ng SPECC1L, kasama sa stabilization na ito ang pinahusay na acetylation ng isang subset ng microtubule 18 .Posible na ang SPECC1L ay gumagamit ng isang katulad na mekanismo upang patatagin ang iba pang mga protina tulad ng AKT.Ipinakita na ang acetylation ng lysine residues sa AKT protein ay humahantong sa isang pagbawas sa lokalisasyon ng lamad at phosphorylation38.Bilang karagdagan, ang ubiquitination ng K63 chain sa parehong lysine residue sa AKT ay kinakailangan para sa localization at activation ng lamad nito39,40.Sa ilang salik na nakikipag-ugnayan sa mga protina ng SPECC1L na natukoy sa iba't ibang high throughput yeast two-hybrid screen, apat - CCDC841, ECM2942, APC at UBE2I43 - ang nasangkot sa paglilipat ng protina o katatagan sa pamamagitan ng ubiquitination o sumoylation.Ang SPECC1L ay maaaring kasangkot sa post-translational modification ng AKT lysine residues, na nakakaapekto sa AKT stability.Gayunpaman, ang kritikal na papel ng SPECC1L sa lokalisasyon at katatagan ng protina ng AKT ay nananatiling maipaliwanag.
Ang matinding mga depekto sa SPECC1L expression sa vivo ay nagresulta sa pagtaas ng AJ marker staining at defective CNCC overlay, pati na rin ang pagtaas ng apoptosis at maagang embryonic lethality.Ipinakita ng mga nakaraang ulat na ang mga mutant ng mouse na may tumaas na antas ng apoptosis ay nauugnay sa mga depekto sa neural tube 44,45,46,47 at mga depekto sa craniofacial48.Iminungkahi na ang labis na pagkamatay ng cell sa neural folds o pharyngeal arches ay maaaring magresulta sa hindi sapat na bilang ng mga cell na kinakailangan para sa tamang morphogenetic na paggalaw 48,49,50.Sa kabaligtaran, ang aming mga linya ng cell na kulang sa SPECC1L na may katamtamang nabawasan na expression ng SPECC1L ay nagpakita lamang ng mga pagbabago sa AJ nang walang ebidensya ng tumaas na pagkamatay ng cell.Gayunpaman, ang pagsugpo sa kemikal ng landas ng PI3K-AKT sa mga Kd cells na ito ay nagresulta sa pagtaas ng apoptosis.Kaya, ang isang katamtamang pagbaba sa expression o function ng SPECC1L ay nagsisiguro sa kaligtasan ng cell.Ito ay naaayon sa obserbasyon na ang mga bihirang Specc11 mutant embryo na nakatakas sa pag-aresto sa st.Ang E9.5—marahil dahil sa pinababang kahusayan sa pagkuha ng gene—ay nagagawang isara ang kanilang mga neural tube at huminto sa paglaon sa pag-unlad, kadalasang may mga craniofacial defects (Fig. S3).Naaayon din dito ang bihirang paglitaw ng mga heterozygous Specc1l embryo na may craniofacial abnormalities—marahil dahil sa tumaas na gene capture efficiency—pati na rin ang paghahanap sa zebrafish kung saan ang isa sa dalawang SPECC1L orthologues (specc1lb) ay nagdudulot ng late embryonic phenotypes, kabilang ang pagkawala ng lower jaws at bilateral clefts51.Kaya, ang heterozygous SPECC1L loss-of-function mutations na natukoy sa mga pasyente ng tao ay maaaring magdulot ng maliliit na kapansanan sa SPECC1L function sa panahon ng craniofacial morphogenesis, sapat na upang ipaliwanag ang kanilang mga orofacial cleft.Ang regulasyon na nakabatay sa SPECC1L ng mga intercellular contact ay maaari ring maglaro ng isang papel sa palatogenesis at pagsasanib ng mga pharyngeal arches.Ang mga karagdagang pag-aaral ng SPECC1L function ay makakatulong na maipaliwanag ang papel ng pansamantalang intercellular contact sa CNCC sa panahon ng pagsasara ng neural tube sa neuroepithelial cell motility at craniofacial morphogenesis.
Ang U2OS osteosarcoma control at SPECC1L-kd cells ay inilarawan dati (Saadi et al., 2011).Ang mga antibodies laban sa SPECC1L ay nailalarawan din dati (Saadi et al., 2011).Anti-β-catenin antibodies (kuneho; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (mouse; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ), MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), cleaved caspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) at β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) ay ginamit tulad ng inilarawan..Ang mga filament ng Actin ay nabahiran ng Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Ang mga control cell ng U2OS at SPECC1L-kd cells ay nilinang sa karaniwang mataas na glucose na DMEM na pupunan ng 10% fetal bovine serum (Life Technologies, Carlsbad, CA).Para sa mga pagbabago sa AJ, ang 2 x 105 na mga cell ay na-seed sa salamin na ginagamot ng 0.1% porcine gelatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) at naobserbahan para sa mga pagbabago sa hugis ng cell.Ang mga cell ay nakolekta sa iba't ibang ipinahiwatig na mga punto ng oras: 4 na oras pagkatapos ng seeding (t = 1), 24 na oras pagkatapos ng seeding (t = 2), confluence nang walang pagbabago sa hugis ng cell (t = 3), pagbabago sa hugis ng cell (t = 4) , 24 h pagkatapos ng pagbabago ng hugis ng cell (t = 5) at 48 h pagkatapos ng pagbabago ng hugis ng cell (t = 6) (Larawan 1, 2, 3).Upang baguhin ang landas ng PI3K-AKT, ang mga cell ay nilinang sa ipinahiwatig na mga konsentrasyon kasama ang PI3K-AKT inhibitor wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) o SC-79 activator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Ang daluyan na naglalaman ng mga kemikal ay binago araw-araw.
Ang mga pag-record ng frame-by-frame ay ginawa sa live na kontrol at mga KD cell sa ilalim ng normal na mga kondisyon ng kultura, at ang mga phase contrast na larawan ay kinokolekta bawat 10 minuto sa loob ng 7 araw.Ang mga imahe ay nakuha gamit ang isang computer-controlled na Leica DM IRB inverted microscope na nilagyan ng mekanikal na yugto at isang 10 × N-PLAN na layunin na konektado sa isang QImaging Retiga-SRV camera.Sa panahon ng imaging, ang mga cell culture ay pinananatili sa 37°C sa isang mahalumigmig na kapaligiran na may 5% CO2.
Dalawang gene trap ES cell line DTM096 at RRH048 mula sa Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) ang ginamit upang makabuo ng mga linya ng mouse na kulang sa Specc11, na itinalagang Specc1lgtDTM096 at Specc1lgtRRH046.Sa madaling sabi, 129/REJ ES cells ang na-injected sa C57BL6 blastocysts.Ang nagresultang chimeric male mice ay pinalaki ng babaeng C57BL6 na daga upang makilala ang mga supling na may kulay na agouti coat.Ang pagkakaroon ng mga pagsingit ng gene trap vector ay ginamit upang makilala ang mga heterozygotes.Ang mga daga ay pinananatili sa isang halo-halong background ng 129/REJ;C57BL6.Ang lokasyon ng insertion site ng genetic trap vector ay nakumpirma ng RT-PCR, genome sequencing, at genetic complementation (Karagdagang Larawan 1).Upang masubaybayan ang linya ng CNCC ng double heterozygous Specc1lGT na mga daga, ang ROSAmTmG (#007576) at Wnt1-Cre (#003829) na mga daga (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) ay tinawid upang makagawa ng ROSAmTmG at Wnt1-Cre allele sa embryos mutant.Ang lahat ng mga eksperimento sa mga daga ay isinagawa ayon sa mga protocol na inaprubahan ng Institutional Animal Care and Use Committee ng University of Kansas Medical Center.
Ang mga embryo ay naayos sa (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) sa loob ng 60 min sa temperatura ng silid.Pagkatapos ng pag-fix sa X-gal staining solution (5 mM potassium ferricyanide, 5 mM potassium ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Ang pagbuo ng mantsa ay isinagawa sa 37°C .°C sa loob ng 1-6 na oras.Ang mga embryo ay post-fixed sa 4% PFA at na-visualize.
Para sa Western blotting, ang mga cell ay na-lysed sa passive lysis buffer (Promega, Fitchburg, WI) na pupunan ng isang halo ng HALT protease inhibitors (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Ang mga lysate ay naproseso sa 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX na yari na gels (Bio-Rad, Hercules, CA) at inilipat sa Immobilon PVDF membranes (EMD Millipore, Billerica, MA).Ang mga lamad ay naharang sa 5% na gatas sa PBS na naglalaman ng 0.1% Tween.Ang mga antibodies ay incubated magdamag sa 4 ° C o para sa isang oras sa temperatura ng silid.Ang Femto SuperSignal West ECL reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA) ay ginamit para sa pagbuo ng signal.Para sa immunostaining, ang mga embryo ay naayos nang magdamag sa 4% PFA/PBS at cryopreserved.Na-block ang tissue cryosections sa PBS na naglalaman ng 1% normal na goat serum (Thermo Scientific, Waltham, MA) at 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) at pagkatapos ay incubated sa 4°C sa isang incubator sa panahon ng gabi.na may anti-antibody at fluorescent secondary antibody (1:1000) sa loob ng 1 oras sa 4°C.Ang mga stained section ay inilagay sa ProLong gold medium (Thermo Scientific, Waltham MA) at ang mga flat na imahe ay nakuha gamit ang isang Leica TCS SPE confocal microscope.Ang bawat immunostaining ay isinagawa bilang tatlong independiyenteng mga eksperimento sa mga cirossection ng hindi bababa sa dalawang mutant embryo.Isang kinatawan na eksperimento ang ipinapakita.
Ang mga cell ay incubated sa binagong RIPA buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, at HALT protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Sa madaling sabi, ang mga lysate ay na-prepurified na may protina G magnetic beads (Life Technologies, Carlsbad, CA) at pagkatapos ay incubated magdamag sa 4° C. na may anti-SPECC1L o IgG protein G protein beads ay ginamit upang kunin ang SPECC1L at ang Western blotting ay isinagawa gamit ang anti -β-catenin antibody na inilarawan sa itaas Ang mga co-IP na eksperimento na ipinakita ay kinatawan ng apat na independiyenteng eksperimento.
Ang mga nakapirming kulturang selula o mouse embryonic tissue ay ibinigay sa electron microscopy center sa University of Kansas Medical Center.Sa madaling sabi, ang mga sample ay naka-embed sa EMbed 812 resin (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymerized magdamag sa 60°C, at na-section sa 80 nm gamit ang Leica UC7 ultramicrotome na nilagyan ng diamond blade.Na-visualize ang mga seksyon gamit ang JEOL JEM-1400 transmission electron microscope na nilagyan ng 100 kV Lab6 gun.
Paano mabanggit ang artikulong ito: Wilson, NR et al.Ang kakulangan ng SPECC1L ay humahantong sa pagtaas ng katatagan ng mga pinagdugtong na joints at nabawasan ang delamination ng cranial neural crest cells.ang agham.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induction at pagkita ng kaibhan ng neural crest.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Cranial neural crest cells sa paggalaw: ang kanilang papel sa pag-unlad ng craniofacial.American Journal of Medical Genetics.Bahagi A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: paglago at pag-unlad nito sa loob ng 20 taon.Pediatrician.patolohiya.laboratoryo.gamot.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU at Noten MM Breakthrough sa genetics ng orofacial clefts.Mga Trend sa Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. at Riley, FM Molecular na mekanismo ng cranial neural crest cell migration at patterning sa panahon ng craniofacial development.Development 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH at Murray, JK Cleft lip and palate: pag-unawa sa genetic at environmental influences.natural na komento.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Abnormal na morphogenesis ng balat, limbs, at craniofacial na rehiyon sa interferon-regulating factor-6 (Irf6) -kulang sa mga daga.Pambansang Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Ang mga nangingibabaw na mutasyon sa GRHL3 ay nagdudulot ng van der Waord syndrome at nakakapinsala sa pag-unlad ng oral periderm.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ at Juriloff, DM I-update ang listahan ng mga mutant ng mouse na may mga depekto sa pagsasara ng neural tube at pag-unlad patungo sa kumpletong genetic na pag-unawa sa pagsasara ng neural tube.Pagsisiyasat ng mga depekto sa kapanganakan.Bahagi A, Clinical at Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling kinokontrol ang kaligtasan ng buhay at paglaganap sa skeletal development sa pamamagitan ng p53-dependent intracellular pathway.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND at Murdoch, JN Disheveled: Kaugnayan ng convergent expansion sa neural tube closure.Mga uso sa neurolohiya.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).